细菌培养操作

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1、细菌培养灭菌物品：试管、枪头、平皿、ep管、涂布棒、培养基。无菌室灭菌：桌子、凳子用质量分数为2%-3%的来苏水擦洗，再用紫外灯照射15分钟。LB培养基的配制：(用于肺炎克雷伯杆菌)(1)称取NaCI1g/100ML胰蛋白丿冻(Tryptone)1g/100ML酵母提取物(丫eastExtract)0.5g/100ML琼脂1.5-2g/100ML(只在配固体培养基吋加)(2)加热溶解(3)调PH7.2-7.4(用NaOH)(4)分装，加塞，包扎(5)灭菌0・1Mpa121.3摄氏度20分钟(6)无菌观察：将已灭好菌的培养基放入37摄氏度的温箱中培养仁2天,若无菌生长放入冰箱储存备用。肉汤

2、培养基的配置：(用于金葡菌)(1)营养肉汤18g/100ML(2)其余步骤同上，但不用调PH玻璃器皿须用干热灭菌法灭菌:(1)试管：每个管口用铝铀纸包好，2个一组用报纸包好。平皿：每组5个，用报纸包好(2)将待灭菌的物品放入烘箱中，但摆放不要太挤，不要接触内壁的铁板，以防止报纸着火。(3)升温至160摄氏度，2小时(4)降温，切断电源自然降温，70摄氏度以下打开箱门，取出物品，防止温度骤降导致玻璃器皿炸裂。镜检：(1)(2)(3)(4)(5)(6)涂片：左手拿试管，右手拿接种环，将接种环在酒精灯上烧红灭菌，烧至伸入试管的部位。用右手的小手指及手边缘部位拔出试管的塞子，将试管口在火焰上烧一

3、圈，然后将接种环伸入试管内取出一环，迅速将试管口在火焰上烧一圈,塞上塞子(此过程塞子一直在手中)。将接种环上的菌液轻轻涂在平板上，涂成直径为1cm的圆。(若在涂的过程中出现回缩现象说明载波片没有洗干净)干燥：涂片在室温下自然干燥，有时为了加快干燥，可将标本面朝上，手持载波片的一端，在酒精灯的火焰上方微微加热，切勿靠近火焰，为宜。固定：加热法：标本面朝上，在酒精灯火焰外层来回通过并不时以载波片反面触皮肤，以热而不烫为度，放置待冷后，染色：标本固定后采用合适的染料进行染色，一般1-3叫番红)safranine染色2分钟。水洗：一般用自来水，将载波片倾斜，沿着上侧使水流缓缓冲下染液，一般以冲下

4、来的水基本无色为度，(不要对者标本直接冲，以免冲去被检标本)干燥：室温中自然干燥或用吸水纸轻轻敷在标本上吸干，干透后镜检(不可在标本上擦拭，以免损伤标本)。热度以不宜烫手均匀3-4次，共约2-3秒,进行染色。分钟。我们用沙红(也显微镜观察:(1)先用低倍镜观察，将载物台升至最高，然后再用粗准焦螺旋慢慢下降，当看到有物象一闪而过时，用细准焦螺旋，找出标本的范围，再换用高倍镜观察，找到最适宜观察部位后换用油镜观察：1.粗调将载物台下降2cm,将油镜镜头转至正下方，在载波片标本上的镜检部位滴上一滴香柏油。2.从侧面观察，慢慢升高载物台，使油镜镜头与标本相连（油镜镜头不能压到标本）3•从目镜观察

5、，先调节光线，再用细准焦螺旋将载物台慢慢下降，直至物象清晰为止。（2）观察完毕，先用搽镜纸拭去镜头上的香柏油，再用搽镜纸醮取少许二甲苯擦去镜头上的油迹，然后用搽镜纸搽去残留在镜头上的二甲苯。（3）样本片的清洁：有盖玻片的用沾有少量二甲苯的擦镜纸把油擦干净，无盖玻片的可用拉纸方擦油（先将擦镜纸盖在油滴上，再滴上二甲苯，平拉试纸，反复几次）（4）把带菌的搽镜纸、玻片放入肥皂水中煮沸，灭菌，清洗。（5）细菌的镜下形态描述：第二代：肺炎克雷伯（Kp）:被染成粉红色，油镜下是分散的小杆状，边缘金葡菌（SA）:粉红色的小圆点，有的是单个存在的有的是以小葡萄形存在的第三代：肺炎克雷伯（Kp）:与第二代

6、相比形状稍大些，菌的长度增加，宽度略增，有的多个在一起金葡菌（SA）：与第二代相比，葡萄串增多（6）通过镜检，选取细菌生长较好的一组，即生长相对较大，较丰满的一组，以备复苏下一代观察细菌在平板上的生长状况：（1）配置固体培养基（2）倒平皿：将灭菌后的培养基冷却至50摄氏度左右倒入平皿中。酒精灯火焰旁拔出塞子；手拿锥形瓶，瓶口通过火焰灼烧灭菌；左手持培养皿，打开盖子，右手将锥形瓶中的液体倒入约15ML,盖上盖子，冷却备用（在涂布前4-5小时制作好，倒放于恒温箱中，除水）（3）接种：制备稀释液（最好10倍稀释一次），如取菌液100uL加到900uL培养基中则稀释了10倍。吸取每一个稀释浓度的

7、菌液100uL,用无菌涂布棒涂布，涂布时可转动平皿使涂布均匀，室温放置20-30min使菌液充分吸入培养基中。（4）培养：接种好的平皿倒置，放入恒温箱中，培养48-24小时，观察生长菌落。