单个核细胞分离

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1、单个核细胞的分离实验目的1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、操作规程。免疫系统免疫器官免疫细胞免疫分子外周血细胞成分淋巴细胞单核细胞粒细胞红细胞和血小板不同细胞密度不同人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090血小板：1.030~1.035细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞,是免疫学实验中

2、常用的细胞群。【实验原理】人外周血单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque比重1.077±0.001）混合分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从而分离出PBMC。Ficoll分层液聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为Ficoll,其密度为1.077±0.001。主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020g/L聚蔗糖(商品名为Ficoll)与1份浓度为3

3、4℅、密度为1.200g/L泛影葡胺水溶液混合。用1.077±0.001的分层液可将细胞分离密度梯度离心(Ficoll)离心试剂与器材1.标本外周静脉血加EDTA-K2抗凝，或1000U/ml肝素抗凝血。2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重(1.077±0.001）有商品供应。3.Hanks液4.台盼蓝染液5.器材水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。操作方法1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然后取1.5ml加入等量Hank液，混匀。2.取1.5mlFicoll分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释血液3ml沿管壁徐徐加入离心管，使

4、稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为1：2），二者之间有一明显的界面。3.用水平离心机以2000r/min离心20min，离心后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取该层单个核细胞，移入EP管，2000r/min5min离心去血浆，加1mlHanks混匀，2000r/min离心5min，弃上清液。5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积用Hanks还原至1ml，取一滴细胞悬液置血细胞计

5、数板内计数，计算单个核细胞的回收率。×100%单个核细胞回收率=分离后细胞悬液ml×每毫升单个核细胞数全血ml数×全血中每毫升单个核细胞数单个核细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数─────────×10×103×2(稀释倍数)46.细胞活力检测取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片，显微镜高倍镜观察。细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个单个细胞数结果判断活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，活细胞应在95%以上。实验讨论1.注意事项①将稀释的血液加分层液上时，一定要细心，动作要轻，使分离

6、液与血液的界面清楚，避免冲散分层液面或与分层液混合影响分离结果。②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液的比重以1.077±0.001为好；小鼠为1.088,而马则为1.090。③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，有缓冲作用，并对细胞无毒性方法评价密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用方法，用该方法不能除去其中的单核细胞。临床意义分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要，可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一。