单克隆抗体的制备1

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1、单克隆抗体的制备一．抗原的制备：（1）全病毒作为抗原（2）病毒特定蛋白作为抗原二．动物免疫三．融合：（1）骨髓瘤细胞准备（2）脾淋巴细胞准备（3）饲养细胞准备（4）细胞融合四．杂交瘤细胞的检测及筛选五．阳性杂交瘤细胞的亚克隆六．腹水的制备---------------------吼吼吼，俺是分界线，吼吼吼------------------------------------------------------------七．单抗特性的鉴定：（1）单抗效价测定（2）单抗特异性鉴定（3）杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定八．单抗的反应性：（1）间接ELISA试验（2）间接免疫荧光试

2、验（3）微量细胞培养中和试验一．抗原制备(一)全病毒作为抗原1.收获病毒①直接收获病毒培养上清液（马立克是细胞结合性病毒，不能用此法）②培养细胞反复冻融-离心（30000rpm离心1h）-重悬（用什么溶液重悬,TNE可以吗）-收获病毒2.反复冻融三次使细胞破碎释放出病毒；（1）提纯浓缩病毒——PEG沉淀法3.慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％PEG(一般使用PEG6000)；4.4℃过夜或放置一段时间；5.8000r/min离心30分钟，收集病毒沉淀；6.病毒沉淀中加入适量PBS，4℃过夜；7.1000r/min离心1小时。沉淀

3、即为浓缩的病毒（2）提纯浓缩病毒——蔗糖密度梯度离心法3.配制25%，35%，45%，55%，65%蔗糖溶液4.用长针管抽取2ml蔗糖溶液，从离心管的底部注入（浓度由低到高）5.抽取1ml病毒液沿管壁缓慢注入6.38000rpm,2h离心7.用注射针抽取离心后出现的病毒条带8.用2mL的PBS溶解9.测病毒浓度（用紫外分光光度计测蛋白质浓度A280）10.一80℃保存备用——病毒的冻存（具体程序是什么）①使用灭菌过的1次性塑料冻存管。贴上标签,标上菌(毒)号及时间,备用。②血清,可用过滤灭菌;牛奶要先脱脂,用离心方法去除上层油脂,一般在100℃间歇煮沸2～3次,每次10～30

4、min,备用。③在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期,进行纯度检查后,与保护剂混合均匀,分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108～1010个/ml为宜。(二)病毒特定蛋白作为抗原1.原核表达载体的构建：①目的基因引物设计②PCR扩增目的片段③选取适当带标签的表达载体与目的片段进行连接④转化，获得阳性质粒。2.蛋白表达：①将阳性质粒转化入表达感受态细胞②挑菌小摇至OD值在0.4-0.6之间时，添加IPTG诱导蛋白表达IPTG浓度：0.1-1.0mmol/l诱导温度和时间：37℃——4h30℃——6h25℃——12h16℃——17h③对诱导的大肠杆菌菌液6000r

5、pm离心10min④用1:100PBS重悬细菌⑤超声波破碎细胞⑥检测蛋白质是上清表达还是包涵体表达1.蛋白质的纯化若蛋白质是上清表达，根据标签直接进行纯化若蛋白质是包涵体表达，先用尿素分离为上清再纯化菌体破碎→离心→等电点沉淀→亲和层析二.动物免疫1.将浓缩后的病毒抗原稀释成浓度为100ug/ml或蛋白浓度（有具体的浓度吗）2.选取5只6周龄左右雌性BALB/c小鼠3.第一次免疫：将抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化,采用腹部皮下多点注射,剂量0.2-0.4mL/只（蛋白腹部皮下注射100ug）第二次免疫：2一3周，将抗原与等量弗氏不完全佐剂充分乳化,皮下多点注射,0.2-0.

6、4mL/只（蛋白腹腔注射100ug）第三次免疫：2周，方法和剂量同第二次4.测血清抗体效价一周，断尾采血，ELISA包板测效价5.选择效价高的小鼠，用不加佐剂的抗原尾静脉注射加强免疫,剂量O.lml/只,(蛋白为腹腔注射100ug)6.3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合三.融合(一)骨髓瘤细胞的准备1.融合前两周：开始复苏骨髓瘤细胞SP2/O,扩大培养,融合时确保SP2/O处于对数生长期（如何确定骨髓瘤细胞处于对数生长期）,有良好的形态（骨髓瘤细胞的正常形态是什么样的）,活细胞计数高于95%2.融合当天,用DMEM不完全培养基将细胞从瓶壁轻轻吹下,收集于SOmL离心管内3

7、.10O0r/nin离心IOmin,弃去上清4.加入30mLDMEM不完全培养基,同法离心洗涤一次5.将细胞重悬于IOmLDMEM不完全培养基中,混匀,制成细胞悬液(二)脾淋巴细胞的准备1.加强免疫后3d：加强免疫的雌性BALB/c小鼠,摘除眼球采血作为阳性血清对照2.颈椎脱臼致死小鼠,浸泡于75%酒精消毒其体表10min,沥干小鼠，随即放入超净台内的解剖板上,腹部朝上,四肢固定;3.钝性分离腹膜，无菌取出脾脏,用无血清含双抗的DMEM于1个皿中，一个用来洗脾并用镊子除去附着的结缔组织4.脾脏移入200