western blot 详解

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1、Westernblot实验介绍及流程垂直电泳、电转装置电泳槽玻璃板、梳子、加样校准架等电转移槽切胶板、黑白夹板、海绵垫等电泳仪用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体（一抗）起免疫反应，再与酶或

2、同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Westernblot实验原理抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂Westernblot检测蛋白表达实验流程SDS-PAGE电泳的基本原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶是在PAGE凝胶中引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-），SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带

3、有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS-PAGE胶中的迁移率主要取决于其分子量的大小。PAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bi

4、s）；催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(freeradicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redoxsystems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。一配分离胶准备物品：玻璃板洗衣粉灌胶架移液枪两个烧杯（1ml200ul20ul）30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=8.8），ddH2O10%AP（-20冰箱），TEMD（4度），SDS（常温）1清洗玻璃板：一

5、只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在通风处或烘箱中2配制分离胶：玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡在架子上准备灌胶。先配制分离胶。配方如下：具体情况依照说明书灌分离胶：用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形。温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶，灌胶速度须缓慢，避免产生气泡灌胶之上轻

6、轻加一层异丙醇，用来压平灌制分离胶隔绝空气ddH2O0.1%SDS:<8%异丁醇：>8%二配制浓缩胶准备物品：移液枪烧杯（1ml200ul20ul）Tips：30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=6.8），ddH2O10%AP（-20冰箱），TEMD（4度），SDS（常温）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝了。倾倒掉胶上层的异丙醇，后用吸水纸吸干。注意吸水纸不要触碰分离胶10%的分离胶配合6%的浓缩胶使用。配制浓缩胶，配方如下：6%的浓缩胶4mlddH2O2.39ml30%Acrylamide0.544ml1MTris-HCL溶液（PH

7、=6.8）1.02ml10%APS40.82ulTEMD2.04ul配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后震荡。灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。冰箱过夜待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。浓缩胶的浓度比较低（5%丙烯酰胺-甲叉双