凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法

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1、凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法   陈邦树广西壮族自治区药品检验所广西南宁530021[摘要]目的：探讨凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法。方法：对实际工作中遇到的一些具体问题进行多侧面的分析。结果：对凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题进行分析并提出了解决方法。结论：凝胶法细菌内毒素检查法影响因素较多，存在的问题仍需多方努力进行克服。[关键词]凝胶法环境内毒素鲎试剂问题 SomecommonlyencounteredproblemsandSolutionmethodsonGel-clotba

2、cterialendotoxinstestCHENBang-shu（GuangxizhuangAutonomousRegionInstituteforDrugControl，Nanning530021）[Keywords]Gel-clot;naturalbacterialendotoxins;TAL;problems细菌内毒素检查法的优越性已为大多数质检人员所体会和认识。但在实际工作中，也有一些问题使实验者感到困惑。因此，作者认为有必要对这些问题提出并加以探讨，供大家参考。1.选择鲎试剂（TAL）的灵敏度值等

3、于样品原液细菌内毒素限值进行试验是最佳方案吗？未必！选择TAL的灵敏度值等于样品原液细菌内毒素限值进行试验，无疑可节省对样品的稀释，但却不利于减少样品溶液对细菌内毒素试验干扰的可能性。中国药典从1998年增补本[1]开始的细菌内毒素检查法已增加了供试品阳性对照（PPC）管，如因样品溶液浓度较高而出现PPC管不凝的情况，会导致试验无效，结果“最佳方案”可能变成重试方案。如今，国内TAL的制备技术得到了较大的发展，更高灵敏度（0.25EU.ml-1、0.125EU.ml-1、0.06EU.ml-1、0.03EU.

4、ml-1）的TAL供应已不成问题。为减少样品溶液对细菌内毒素试验的干扰和避免上述重试情况的产生，不如开始就选择更灵敏的TAL并对样品原液作MVD稀释后进行试验。2.阳性管（PC管）不凝，为什么？原因无非3个方面。⑴、试剂问题〔包括内毒素和TAL〕。⑵、实验条件问题。⑶、操作问题。近年，国产TAL活性较稳定，其稳定性可达室温保存2-3年；细菌内毒素亦具有耐热性，通常在其有效期内常温保存或运输其活性不受影响。唯需注意的是，使用小装量的试剂（包括内毒素和TAL）较使用大装量的试剂容易导致PC管不凝的情况发生。这是由

5、于小装量的试剂较之大装量的试剂更不易控制支间差异所致。尽管如此，我们仍有理由相信在大多数情况下试剂不是造成PC管不凝的主要原因。如我们自1995年使用旋涡混合器以来，在本所实验室条件下，细菌内毒素试验尚未见到PC管不凝的情况。个别单位发现PC管不凝后，把TAL及内毒素拿到本实验室再进行试验，结果PC管凝得很好。但是，当我们自备试剂到外单位抽检并就地进行细菌内毒素试验时，却在2个实验室发现过PC管不凝的情况。究其原因，认为保温环节出问题的可能性最大。一次是保温过程中水浴箱电源插座接触不良，恒温不能保证，实验结束

6、时发现水浴温度已由原来的37.2℃变成了36.0℃；另一次是某单位使用无盖式恒温水浴锅代替有盖式电热恒温水浴箱，水表层的温度可能并未达到37℃。由于TAL的成胶时间与温度在一定的范围内呈负相关。温度偏低将使成胶时间延长。这样，在规定的时间里PC管不凝也就不足为奇了。造成水浴温度实际偏低的另一原因，还可能是因为实验者把温度计放在发热管附近监测反应温度所致。我们主张采用电热恒温水浴箱上的水银温度计监测反应温度。精确的控温是试验取得准确结果的重要保证。此外，操作上我们还应注意内毒素的溶解稀释过程要按药典的规定进行（

7、振荡的时间及强度要保证），以使内毒素的磷脂A部分（毒力活性部位，也是与TAL结合的部位）能通过激烈振荡充分暴露。3.同一批检品进行多次细菌内毒素检查时，有时判为合格有时判为不合格，为什么？怎么办？假如操作和实验条件均可信赖（符合药典要求）的话，那么上述问题大体可表述为3种情况：1、同一批检品用同一厂家的TAL（灵敏度相同或不同）检查结果不同。2、同一批检品用不同厂家的TAL（灵敏度相同或不同）检查结果不同。3、同一批检品但不同瓶用同一厂家的同一批TAL检查结果不同。我们知道，药典规定TAL的灵敏度实测值即使是

8、其标示值的50%-200%仍认为是合格的TAL，实验时应以其标示的灵敏度为准。正是这个原因便足以导致上述前两种情况的产生而不一定是不同厂家的原因。例如：有2批TAL（厂家相同或不同）的标示灵敏度均为0.25EU.ml-1，由同一人使用同一支细菌内毒素国家标准品同时复核灵敏度，实测值分别为0.5EU.ml-1（为标示值的200%）和0.125EU.ml-1（为标示值的50%），结果均应判为合格。实验时