利用重组酵母菌生产人胰岛素

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1、利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分

2、批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定UsingrecombinantyeasttoproducehumaninsulinHuSheng1142043040Abstract：Theproceedingsofproducehumaninsulinbyrecombinantyeastshowasfollow:getpurposegene→constructtherecombinantp

3、lasmid→constructthegeneticengineeringbacteria→fermentationofengineeringbacterium→separationandpurificationoftheproduct→identificationoftheproduct.Thefrontthreeprocessesisbuildingengineeringbacteriaofhumaninsulinyeasts.Insulingenewassynthesizedaccordingtotheaminoacidsequen

4、ceofhumaninsulinandyeastpreferentialcodons.TheinsulingenewasclonedintopPIC9vectorandexpressionvectorpPINS319wasconstructed.TheexpressionvectorwasdigestedwithBgllIandthenusedtotransformPichiaPastorisGSll5byelectroporation.Theexpressionanalysisshowedthattheinsulingenewsable

5、toexpressedefficientlyinPichiaPastoris.Theposteriorthreeprocessesislarge-scaleproductionbyfermentation.Throughfed-batchfermentationgettingfermentationliquor,separationandpurificationthefermentationliquorgettinghumaninsulin.Thefinalproductspurifiedbysupedrex75showedoneband

6、bySDS-PAGEanalysisandwereidenticalwiththenativehumaninsulinbyallcritetiaemployed.(SDS-PAGEanalysis,aminacidcompositionanalysisandbioidentityassay)Keywords：recombinantyeast;humaninsulin;fermentation;purification;identification胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。最初的重组表达是通过大肠杆菌分别表达出胰岛素

7、的A链和B链。现在，胰岛素作为重组蛋白产品，主要有两条途径获得。一条途径是在大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体，通过溶解和复性等过程获得胰岛素。另外一条途径是通过酵母表达系统，分泌表达可溶性的胰岛素前体进入培养液。由于对酿酒酵母大规模培养有丰富的经验，使其成为了第一个分泌表达胰岛素前体的酵母系统。虽然酿酒酵母仍然是主要的胰岛素产品表达系统，近些年几个备选的表达系统也提供了可能性。其中，毕赤酵母是一种非常有用并且优势明显的表达宿主。尤其是它强有力的醇氧化酶启动子，受甲醇严格诱导调控，通过简单培养可以达到较高的细胞密度，能够稳定且高水平表达外源

8、蛋白。利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建；后三个流程为胰岛素的大规