ABI测序的基本原理和应用

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1、测序分析的基本原理和应用1主要内容•测序反应•荧光标记ddNTP/荧光标记引物•BigDye®Terminator的不同版本•模板制备•引物设计•测序反应产物纯化2测序反应3测序反应–双脱氧末端终止法5’OO无3’OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入O5’3’H3’HO43’OH测序反应变性DNA模板退火引物AGTCA测序酶荧光标记的ddNTP（BigDye®Terminator）延伸/终止dNTPs5荧光标记的测序反应产物°ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个dNTP的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。°测序反应的延伸阶段，ddNTP在

2、不同位置掺入产生一系列不同长度的新的DNA片段。6基因分析仪的基本构造计算机分析测序数据CCD相机记录所有通道信号毛细管激光激发所有通道电泳方向高压电源7DNA测序示意图DNA测序示意图CTTGCATGAC序列用点的大小代表DNA分子的大小，颜色代表DNA所标记的颜色。信号检测窗口毛细管进样端8化学原理9“荧光标记ddNTP”vs“荧光标记引物”荧光标记ddNTP荧光标记引物•单管反应(+)•四管反应(-)•非标记引物(+)•仅需要M13正向和反向测序引物•无错误终止•荧光信号均一(+)•不建议用于毛细管电泳(Compressions)•最新一代的BigDyeTerminator测序试剂

3、盒的荧光信号非常均一，99.9%的客户都在用此试剂盒进行测序。10dNTPs/ddNTPs比例的重要性测序反应ddATPdATPddATPdTTPddGTPddGTPdGTPdATPddCTPddCTPdCTPdCTPddTTPddTTPdTTPdGTPddATPddATPddCTPdCTPddGTPdGTPddTTPdGTPdNTPs/ddNTPs比例0低高∝单碱基延伸主要是较短的主要是较长的无荧光信号延伸产物延伸产物→不同的测序试剂盒用于不同的测序应用注意：如果进行PCR产物测序，重要的是要在测序反应前要去除PCR产物中残留的dNTPs11BiggyDye®Terminator测序试

4、剂盒-概况版本1.1版本3.1荧光最初的BigDyekitBigDyekit提高测序酶活性的BigDekitBigDyekitdNTPs/ddNTPs比例“原始的”适于长片段测序测序酶热稳定，适于困难模板测序缓冲液试剂盒配有5xBigDyeSequencingBuffer12BiggyDye®Terminator测序试剂盒-应用应用V3.1V1.1•v3.1用于大部分应用原始(denovo)测序+−De-novo测序再测序+−再测序困难模板测序++长片段测序+各种模板类型测序(质粒,,,BACs,•vv.1.1用于特殊的应用+和fosmids)−用快速电泳程序进行的短混合碱基检测

5、（SNP）+用快速电泳程序进行短片段测序+PCR产物测序+RecommendedSatisfactory−靠近测序引物的序列判读更多信息请参考BigDyeTerminatorv31Terminatorv3.1和v11CycleSequencingKitsv1.1CycleSequencingKits的产品彩页13BiggyDye®Terminator测序试剂盒测序举例:杂合子检测v1.1v3.1注意：用v3.1可以得到更均一的测序峰，更好地区分混合碱基。14BigDye®Terminator测序试剂盒测序举例:测序起点v3.1FirstbaseFirstbasev1.1•如果想读出

6、测序引物邻近的序列或在测序产物开始的50个碱基内区分出杂合子，请选择BigDye®Terminatorv1.1kit。15测序模板制备16测序模板制备：质粒•碱裂解法提取质粒，要用RNA酶消化和PEG沉淀•CsCl层析•商业化试剂盒(MagMax,Tri-Reagent,Centri-Sep)•注意:−避免超出纯化柱的DNA载量−可能需要额外的脱盐步骤17测序模板制备：PCR产物•去除PCR反应液的残留−残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序−残留的dNTPs：以保持dNTPs/ddNTPs的最佳比例−盐成分：避免抑制测序酶活性−非特异PCR产物：避免扩增出同源性区域ExoI/SAP消

7、化柱纯化稀释胶回收纯化测序反应18PCR产物纯化方法•依赖于−PCR反应的优化程度−PCR产物的质量Î选择最佳的纯化方法19胶回收纯化•可用于任何质量的PCR产物纯化-优势:–去除非特异PCR产物和引物二聚体-缺点:-重复性差，得率低"-费时-紫外照射可能会破坏DNA链→切下条带，然后用商品化试剂盒纯化20柱纯化•用于特异PCR产物纯化或存在<100bp的非特异产物的纯化(如：引物二聚体)-优势：-简单、快速-重复性好-缺点：-成本