固定化酶制备及酶活力测定

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1、协同致远创新至尖绿色发展和谐制药固定化酶制备及酶活力测定实验者：张伟达绿色制药1402班201430360226同组者：张朝焕、张颖琼实验日期：2016年5月30日报告完成日期：2016年6月1日指导老师：易喻【摘要】酶的固定化技术是用物理或化学方法处理水溶性酶使之成为不溶于水或溶于固定相载体后仍具有活性的酶的衍生物，固定化酶不但具有一般酶的特性，而且还可以长期重复使用，具有较高的经济效益。本实验采用包埋法进行酶的固定化，并使用福林酚法测定碱性蛋白酶的酶活力（即酶所催化的化学反应的速度）。根据实践可知：包埋法固定化酶条件相对温和，能够重复使用，

2、但方法本身会一定程度上造成酶的活力的降低。【关键词】固定化酶技术酶包埋法福林酚法酶活力【Abstract】Technologyofimmobilizedenzymeisphysicalorchemicalmethodswereusedtodealwithwatersolubleenzymetobecomeinsolubleinwaterordissolvedinstationaryphasecarrierstillhasderivativesoftheactivityoftheenzyme,immobilizedenzymenotonlyhas

3、generalenzymaticproperties,butalsocanberepeatedlyusedforalongtime,hashigheconomicbenefit.Inthisexperimenttheembeddingmethodofenzymeimmobilization,andusingtheFolinphenolmethodforthedeterminationoftheenzymeactivityofalkalineprotease(i.e.,theenzymethatcatalyzesthechemicalreacti

4、onspeed).Accordingtothepractice,itcanbeknownthattheconditionofimmobilizedenzymeisrelativelymild,andcanbeusedrepeatedly,butthemethoditselfwillcausetheenzymeactivitytobereducedtoacertainextent.【前言】酶的固定化是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶

5、于水的，但仍具有酶活性的状态。酶活力指酶催化某些反应的能力。酶活力可用一定条件下它催化的某一化学反应的反应速度来表示。为了灵敏起见，通常测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度随时间推移而降低，为正确测得其活力，必须测定反应的初速度。碱性蛋白酶在碱性条件下可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可以福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。利用比色法测定酪氨酸的量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。1协同致远创新至尖绿色发展和谐制药1.实验过程1.1试剂与仪器1.1.1试剂①海藻酸钠，

6、0.3%氯化钙②碱性蛋白酶（1.0mg/mL）③福林试剂④1%酪蛋白溶液⑤pH10缓冲液⑥标准酪氨酸溶液⑦0.4mol/L碳酸钠溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液1.1.2仪器①磁力搅拌棒②恒温水浴锅③注射器④烧杯（100mL，500mL）⑤布氏漏斗⑥分析天平⑦容量瓶⑧移液管⑨721分光光度计1.2操作步骤1.2.1酶的固定化称取1.00g海藻酸钠于盛有30mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20mL。用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200mL3.0％氯化钙溶液

7、的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2~3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。1.2.2酶活力的测定1.2.1.1制备酪氨酸标准曲线（1）取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下表）（2）在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴中保温15min，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。2协同致远创新至尖绿色发展和谐制药（3）分别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶

8、液5mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15min，然后于每管中各加入3mL蒸馏水，充分摇匀。（4）用721型分光光度计，以0号管作对照