烟草不育系与保持系线粒体DNA的重测序研究

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1、烟草不育系与保持系线粒体DNA的重测序研究李安等摘要：基于重测序技术，对两对不冇系和对应的保持系材料的线粒体DNA进行重测序，统计并分析了不育系与保持系线粒体DNA编码区序列的突变位点，探讨了这些突变位点与烟草胞质不育的关系。对重测序结果比对分析可知：不育系和保持系在orfl06b上具有一致的]个InDei位点,在orfl38a>orfl21b.orfl29b和orfllOb上具有一致的SNP位点，这些突变位点没有造成不育系与保持系编码区序列的差异，推测这些突变位点可能与CMS无关；不育系MSK326和MSK394在orfll2a和orfl03c上有相同的InDei位点；MSK326和M

2、SK394在65个某因片段或开放阅读框上冇一致SNP位点，仇这些突变没冇出现在保持系线粒体编码区。这些基因片段或开放阅读框上的InDei和SNP突变都导致了基因或开放阅读框编码序列的改变，并造成了氨棊酸的突变，推测可能与烟草CMS密切的相关。其中atpl、atp4、atp6、coxkcox3、atp9、orf25、nad6^nad7>orfl08、orf239、orfl29^sdh4等基因或开放阅读柿LL的突变位点与报道研究一致，均被报道与烟草cms存在密切的联系。本研究所挖掘的这些大虽基因片段上的InDei和SNP位点，不仅冇助于烟草CMS机理的进一步研究，也为烟草不育系育种研究提供有

3、力的遗传工具。关键词：烟草；线粒体DNA；重测序重测序是指对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因纽测序，并在此基础上对个体或群体进行若异性分析。在全基因组水平上扫描并检测与重要性状和关的基因序列差异和结构变异，实现遗传进化分析及重要性状候选垄因预测。由于其具冇检测全面、真实可靠、快速容易等优点，受到越来越多的关注。R前，国内外学者将基因组重测序广泛运用在水稻、拟南芥、黄瓜、油菜等物种中，成功定位了黄瓜早花基因、水稻抗稻瘟病、不育性等基因。但是在烟草不育机理的研究中，仍然以通过SSR和RAPD标记以及基因克隆等分子技术为主，重测序技术在烟草不冇机理研究屮应用较少。烟草雄性不育的形成十分复

4、杂，目前广泛认为是控制雄性不育性的遗传物质发生了变异,导致烟株体内生理生化过程的改变，促使烟株细胞形态发生变化，从而形成雄性不育卩]。大量研究表明烟草雄性不育是细胞质与细胞核共同调节的结果，但主要是线粒体DNA上发牛的一些变异或者缺失，导致线粒体功能遭到破坏而发牛紊乱，花粉不能正常发育，造成花丝缩短、花粉囊枯皱等现象[2-3],从而引起焰草雄性不育，即细胞质雄性不育(CMS)[4]oNair认为胞质雄性不育性的遗传因了位于线粒体基因组⑸。Bergman等⑹发现不育系线粒体基因atpl同orf274共转录本升高导致其ATP/ADP比率显著降低是该不育类型不育的一个特点。赵婷等⑺和朱腾义等⑻

5、分别获得了不育系存在显著和关性的atp6和coxll基因SNP位点。刘齐元等⑼发现不育系和保持系线粒体基因纽有明显的差界，但是对胞质不育类型的烟草雄性不育分子机理尚未展开研究。通过线粒体DNA重测序技术，对比分析不育系与保持系的线粒体DNA序列差异，得到与烟草雄性不冇相关的SNP位点，以及系统的挖掘与烟草雄性不冇形成相关的基因，为揭示烟草细胞质雄性不育的分子机理奠定实验依据。対积极选育烟草雄性不育系，开辟烟草杂种优势利用的新前景有其重要的实际意义。1材料和方法1.1试验材料试验在湖南农业大学中南烟草实验基地进行。以保持系K326、不育系MSK326.保持系K394和不育系MSK394等烤

6、焰品种为材料，两対材料是严格的同核片质材料°1.2试验设计试验材料于2015年12刀26LI播种，采用漂浮育苗。成苗后，对材料进行遮光处理培养。选取长势一致的黄化苗制备线粒体DNAo将制备好的符合要求的DNA样品送测序公司重测序检测。1.3mtDNA的制备参考李文强等［10］和李凤霞等［11］方法，改进GENMED公司高多糖/酚植物线粒体DNA萃取试剂盒提取方法制备本试验材料线粒体DNAo1.4mtDNA的质量及纯度检测取7.5LmtDNA样品与1.5uL6Xloadingbuffer用稳压电泳仪在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。运用凝胶成像系统（美国AlphaInnotech公司）拍照保

7、存。取1uLmtDNA溶液,加超纯水稀释至100uL,用EppendorfBioOhotometer分光光度计测出A260/A280>A260/A230及mtDNA浓度。将检测符介的线粒体DNA送诺禾致源生物技术公司重测序。1.5数据处理少分析分析得到的垂测序结果，采用Excel2003和SPSS软件进行。2结果与分析2.1烟草线粒体DNA的制备和检测2.1.1烟草线粒体DNA琼脂糖凝胶电泳检测通过差速离心的方法，获得烟草线粒体，然