菌落总数与大肠菌群数测定

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1、菌落总数与大肠菌群数测定哈尔滨医科大学公共卫生学院卫生微生物学教研室主要内容水样的采集与送检菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理（拓展内容）水样的采集和送检采样瓶：洗净、包扎、灭菌自来水：烧灼龙头，放水5-10min中和余氯：每500ml水样，预加1.5%Na2S2O32ml水源水：距水面10-15cm送检时间：<=2h(常温)，<=4h(冷藏)采样瓶烧灼水龙头菌落总数测定实验目的掌握菌落总数测定方法实验原理不同稀释度的水样，营养琼脂培养基，37℃，24h，菌落数菌落总数测定器材与试剂：水样，无菌蒸馏水，营养琼脂培养基，1ml吸管，10ml吸管，平皿菌落总数测定实验步骤1.

2、稀释水样：10ml水样加入90ml无菌蒸馏水、振荡、彻底混匀2.做1：10系列稀释三支9ml无菌蒸馏水试管3.倾注培养1ml稀释水样、15ml培养基（45℃）4.倒置培养：37℃，24h倾注培养培养结果菌落总数测定实验步骤5.菌落计数：肉眼观察，可用放大镜，可标记必要时分区计数，菌落成片者作废计算方法某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值选择菌落数在30-300之间的稀释度（1）仅有一个稀释度在此范围：菌落数×稀释倍数菌落总数测定计算方法：（2）有两个稀释度在30-300之间菌落数之比>2，选较小值菌落数之比<2，取平均值（3）所有稀释度均>300取稀释倍数最大者（4）所有

3、稀释度均<30取稀释倍数最小者（5）没有任何稀释度在30-300之间选最接近该范围者结果单位：CFU/ml菌落总数测定注意事项：1.无菌操作2.标记3.何时更换吸管4.吸吹混匀5.琼脂培养基保温6.安全常识大肠菌群数测定实验目的实验原理37℃，24h，乳糖，产酸（溴甲酚紫），产气（小倒管）三步法：初发酵、分离培养、复发酵器材与试剂水样、无菌蒸馏水、乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基，革兰染液1ml吸管、10ml吸管、试管、平皿、载玻片初发酵器材与试剂水样、90ml无菌水、9ml无菌水、5ml三倍乳糖蛋白胨，10ml吸管、1ml吸管、酒精灯、吸球大肠菌群数测定实验步骤：1.初发

4、酵（1）10ml水样+3倍乳糖蛋白胨培养液（5ml）（2）三个稀释度（原水样，1:10和1：100），各取1ml+乳糖蛋白胨培养液（10ml）（3）培养：37℃，24h（4）观察指标：产酸（黄色），产气（倒管内有气泡）吸取水样加注水样初发酵结果左2为阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生。大肠菌群数测定实验步骤2.分离培养（1）制备伊红美蓝平板：45℃，无菌，倾注，15ml（2）选产酸产气的发酵管（3）接种至伊红美蓝平板分区划线法（4）培养：37℃，24h分离培养器材与试剂初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区

5、划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环分区划线法操作要点1.划下一个区前必须灭菌接种环2.划线时接种环同平板呈30-40°角3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动大肠菌群数测定实验步骤2.分离培养：（5）菌落特征：深紫黑色、有金属光泽紫黑色、无或略有金属光泽淡紫红色、中心颜色深（6）革兰染色、镜检：选特征菌落革兰染色法器材与试剂结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸革兰染色法涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定：通过火焰若干次初染：结晶紫一滴，1min，水洗媒染：卢戈碘液一滴，1min，

6、水洗脱色：95%乙醇，30s或至无色为止复染：复红一滴，30s涂片热固定初染媒染脱色复染革兰氏染色阴性革兰氏染色阳性革兰染色法复发酵器材与试剂培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管大肠菌群数测定实验步骤3.复发酵（1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液（3）培养：37℃，24h（4）观察指标：产酸，产气液体接种复发酵复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生大肠菌群数测定注意事项：1.无菌操作2.吸管使用3.洗去染液的方法4.显微镜保养5.液体接种MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMet

7、hod）目的：对某种细菌进行选择性计数核心思想：泊松分布实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:P(x=k)=e-x×xk/k!x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：其中C为常系数V为总水样量，x为细菌个数MPN法原理3.当y(x)max，XMPN4.由于y(x)