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1、EPO糖基化类型及作用韩云波王佳彬70k生命基地沈阳药科大学主要内容（一）EPO的简介（二）N-糖基化（三）唾液酸对活性的影响（四）新型EPO（一）EPO简介[3]人类EPO含有166个氨基酸,相对分子质量为34400,有4个糖基化位点,其中3个N-糖基化位点(Asn24,38,83)和1个O-糖基化位点(Ser126),并有2个二硫键连接。其中60%是蛋白质(单个多肽链),40%为糖类。糖基化对稳定EPO的体内活性具有重要作用,若缺乏糖链,则EPO在体内迅速被水解而失活，而在体外增强。rHuEPO的一级结构、Glu-C酶解片段[5]
2、EPO简介[3]天然存在的EPO分为两种类型,α型含34%的碳水化合物,β型含26%的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。EPO主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成。EPO简介[２]近年来研究显示，仅能进行N-连接而不能进行O-连接的糖类对EPO功能的产生具有重要意义.（二）EPO的N-糖基化研究表明,EPO的N-糖基化程度对EPO的体内活性有相当大的影响。N-糖基化不完全的rhEPO体外活性正常,而体内活性则降低到体外活性的1/500,其体内被清除的速率也明显降低[9]。EPO
3、属于内源性物质,正常人体液中含量很低,半衰期短。rhEPO与内源性EPO的氨基酸序列完全相同,仅糖基部分有微小的差别[10]。rhEPO比天然EPO含有更多的三天线及四天线低聚糖,并且二者在唾液酸化程度上有明显的差别[11,12]。rhEPO糖基化性质与rhEPO的生物学功能关系密切,且是内源性EPO与外源性EPO的区别所在。rHuEPO中氮连接寡糖的结构和类型氮连接寡糖分为3种类型,即高甘露糖型、杂种型和复杂型。rHuEPO中氮连接寡糖为复杂型寡糖。该类型寡糖在组成上可分为糖核部分、天线部分及末端唾液酸部分。其中糖核部分是固定不变的
4、,而天线部分可为二天线、三天线、四天线,最多只能为四天线,天线的组成为乙酰氨基乳糖,且可增加一个乙酰氨基乳糖单元,末端为唾液酸,唾液酸较易脱落。EPO中的四天线寡糖是氮连接寡糖中分子量比较大的。rHuEPO中氮连接寡糖的结构和类型通过MALDI/TOFMS分析各个位点的寡糖肽,表明二天线寡糖主要在24位点上,38和83位点主要以多天线为主。国产EPO的寡糖唾液酸乙酰化的程度高,大部分寡糖的唾液酸都被乙酰化了，多天线唾液酸乙酰化有助于EPO在体内的抗酶解,降低代谢速率,提高生物活性。3个氮连接寡糖位点的微不均一性利用糖肽中肽段的辅助离子
5、化作用,将唾液酸和寡糖作为一个整体分析。将国产rHuEPO用Glu-C酶解,HPLC分离,ESI－MS在线监测含糖位点,并用在线ESI－MS分析83和38位点氮连接寡糖的微不均一性,MALDI/TOFMS分析了3个糖基化位点的寡糖的微不均一性。（三）唾液酸含量对其体内生物学活性的影响[8]EPO分子中糖含量与其体内生物学活性相关早有报道[6]。正常EPO分子内唾液酸含量约10mol/molEPO[7]。唾液酸存在于糖链的末端,有报道指出分子中唾液酸含量低的EPO分子,糖链末端的裸露的半乳糖残基容易被肝细胞上的受体所识别,从而被肝细胞吸
6、收分解,降低了体内的生物半衰期,是其体内生物学活性低的原因[7]。唾液酸含量对其体内生物学活性的影响[8]体内生物学活性低的EPO的相对分子质量也较体内生物学活性高的EPO的低。推测是由于EPO分子糖基化不完全,特别是高分枝的糖链结构少,有效唾液酸化的糖链末端少,因而生物学活性低。还有研究表明：糖链以4条分枝为主(完全由唾液酸构成)的EPO，其活性相当于“标准”的EPO活性，而以2条分枝为主(完全由唾液酸构成)的EPO，其活性在体外3倍多于“标准”EPO，而在体内则仅为正常活性的15%。糖基化与生物活性关系[4]采用间苯二酚显色法测定
7、rhEPO的唾液酸含量;网织红细胞法测定rhEPO的生物活性;并对二者进行相关性分析。糖基化与生物活性关系1唾液酸含量测定 间苯二酚显色法糖基化与生物活性关系2EPO唾液酸含量与生物活性关系分析以唾液酸与rhEPO蛋白比值为横坐标,以比活性为纵坐标制作曲线,见图1糖基化与生物活性关系糖基化与生物活性关系本次实验总结①随着唾液酸含量的增加,生物活性随之增加,具有显著正相关性,但增加的幅度无一定的规律;②当唾液酸/EPO值≤8.28时,生物比活性小于120000IU/mg。结论成熟的重组人红细胞生成素(rhEPO)是由166个氨基酸残基组
8、成的高度糖基化蛋白。糖基化的程度对其生物活性有很大的影响。通过实验,我们认为重组人红细胞生成素唾液酸含量高低与其生物比活性具有显著的相关性,当唾液酸含量低时,则生物活性低,这与国内有关报道相符。正常EPO分子内,唾液酸含
