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《柴胡疏肝散抗肝纤维化实验探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、柴胡疏肝散抗肝纤维化实验探究作者：付德才杨世忠宋祥福【摘要】目的探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型aSMA、TGFB1的影响及其抗纤维化的机制。方法采用40%CC14皮下注射，制备肝纤维化模型并以柴胡疏肝散干预,测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织務脯氨酸(HYP),光镜观察肝组织病理变化，免疫组织化学法检测肝组织aSMA、TGFBl表达，RTPCR检测TGFBlmRNA的表达。结果柴胡疏肝散组较模型组:肝功能明显改善，血清HA及LN显著降低，肝组织HYP含量明显少，肝组织纤维化程度明显改善,肝组织aSMA及TGFBl表达减少。结论柴胡疏肝散对CC14诱导
2、的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。【关键词】柴胡疏肝散；肝纤维化；aSMA；TGF31近年来柴胡疏肝散抗肝纤维化的临床研究取得了较好的临床效果〔1〕，但目前国内外尚无柴胡疏肝散抗肝纤维化的基础研究。本实验采用四氯化碳(CC14)大鼠肝纤维化模型，观察柴胡疏肝散的抗肝纤维化作用，并探讨其对a平滑肌肌动蛋白(aSMA)、转化生长因子(TGFBl)影响及柴胡疏肝散抗肝纤维化的理论机制。1材料与方法11材料111动物及药物雄性22月龄Wistar大鼠60只，体重300〜350g,由吉林大学实验动物中心提供。柴胡疏肝散（柴胡6g,陈皮6g,川苇5g,香附5g,枳壳5g,赤芍5g,甘草3g,
3、由长春中医药大学附属医院提供）经冷水浸泡药材2h,常规两煎，头煎15h,二煎lh,两次水煎液混合并过滤，经水浴蒸发浓缩成含生药112g/ml的浓缩药液冷藏备用。按体表面积折算，大鼠每天的柴胡疏肝散等效剂量为28g/kg（体重）。112药品及试剂CC14购自北京北化精细化学品有限责任公司）；秋水仙碱（colchicine）购自昆明股份制药有限公司；谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒购自上海科欣生物技术研究所；血清总胆红素（TBIL）试剂盒购自上海科华东菱诊断用品有限公司；透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）放射免疫分析测定盒购自上海海军医学研究所生物技术中心；单克隆急用型鼠抗人生aSM
4、A试剂盒购自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGFB1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB购自北京中山生物公司，RTPCR两步法试剂盒购自TAKARA公司，Trizol购自Sangon公司。12方法121模型制作参照文献〔2〕方法：实验第1天除正常空白对照组（对照组）外，其余动物皮下注射CC14分析纯05ml/100g（体重），以后每隔3d注射40%CC14橄榄油剂03ml/100g（体重），连续8wo实验前2w饲喂高脂玉米粉饲料（795%玉米粉+20%猪油+05%胆固醇），第3〜6周饲喂100%玉米粉和30%乙醇饮料。122
5、分组及给药方法将60只大鼠随机分为4组,每组15只，第1组对照组，饲喂正常饮食；第2组模型组，按上述造模方法给予饮食；第3组柴胡疏肝散治疗组，于造模3w开始，给予柴胡疏肝散煎剂灌胃，每日28g/kg；第4组秋水仙碱组，于造模3w开始给予秋水仙碱01mg/（kg•d）-l,共8Wo123标本制作上述造模及处理过程结束日，禁食12h后称质量，股静脉取血，分离血清置-2（TC保存；并立刻完整摘取肝脏及脾脏，称质量后用生理盐水漂洗肝左叶数次，滤纸拭干后，切取02g置于冰浴中的组织匀浆器内，加入冰生理盐水2ml,制备成100g/L肝组织匀浆，4000r/min4°C离心，取上清液保存于-
6、20°C。肝右叶置于40g/L中性甲醛液中常规固定后，石蜡包埋，用于制作组织芯片。13检测指标131血清及组织纤维化指标检测测定血清肝功能包括总胆红素（TBIL）.丙氨酸氨基转移酶（ALT）、白蛋白(ALB)、A/G,检测透明质酸(HA),III型前胶原(PCIII),N型胶原(CN),层黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝匀浆检测軽脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，均按试剂盒说明书操作。132病理检测组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分
7、系统(SSS)〔3)进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。133免疫组织化学检查aSMA、TGFB1采用石蜡包埋常规切片,SP法，兔抗鼠TGFB1,多克隆抗体及鼠抗鼠aSMA单克隆抗体均以1：100稀释,DAB显色，苏木素复染。PBS代替一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色，阴性组织呈蓝色在全自动图像分析系统上，采用HPIAS2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(X400)倍测定阳性细胞的A值与所占视野面积，取其乘积平均值为该组织切片所得值，两项乘积越大表明组织中该抗原含量
