临床ELISA反应影响因素(讲稿)

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1、临床ELTSA检验影响因素临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标木的收集保存、试剂准备、加样、温冇、洗板、显色、比色、结呆判断和结果报告及解释等方而，其中任一步骤的不当都会影响测定结呆，且尤以加样、温冇和洗板等步骤为其。现分述如下。一.临床标木的收集和保存用于ELISA测定的临床标木蝕为常用的是血清(浆),冇时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标木。冃前临床上使用血清标木测定的标志物一般冇传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激索、特种蛋白、细胞因了和治疗药

2、物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时I'可其或体位有可能会对测定结果产住影响。如可的松在早晨4〜6点之间，会有--峰值出现：住长激索、促黄体激索(LH)和促卵泡激素(FSH)均以阵发性方式禅放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间I'可隔内采取数份血样本，以其小间值为测定值。乂如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标木的收集则没冇时间和体位方面的影响，只是在

3、处理和保存方面要考虑以下几个方面：(1)要注意避免岀现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记陆的EIJSA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的IIRP底物反应显色。(2)样本的采集及血清分离屮要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的牛长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的B-半乳糖件酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。(3)血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2〜8°C下保存一

4、周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70°C以下(4)冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标木的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。(5)标木在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物吋，应离心沉淀后取上清检测。二、试剂准备在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱小拿出来即用，而忽略了这利1做法有可能影响后面温育吋I'可不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳

5、性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定屮试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后血的温育反应步骤屮，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品EIJSA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸憎水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以0PD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。三、加血清样木及反应试剂在现在的ELTSA商品试剂盒中

6、，血清样木的加入几乎是唯一的要使川微量加样器加入样木的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不町太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特界吸附。溅出会对邻近孔产牛污染。出现气泡则反应液界面有差界。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔Z间的现彖，这样就会在孔内的非包被区出现非特杲吸附，从而引起非特界显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性

7、，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错课所致。四、温育温育是EL1SA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特界抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度冇37°C和室温，其次是43°C和2〜8°Co温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常H前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37°C30分钟〜1小时，进UEL1SA试剂

8、盒则通常为37°C1〜2小时才能有较完全的结合，低于1小吋，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：(1)要保证在设定的温度下有足够的反应吋间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板