人教新课标选修难点剖析（12基因工程的基本操作程序）

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1、难点剖析知识•巧学一、目的基因的获取基因操作的笫一步，是取得人们所需要的特定基因，也就是H的基因。例如，前面捉到的苏云金芽他杆菌中的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、利

2、子的储藏蛋白的基因，以及人的胰岛索基因、T扰素基因等，都是目的棊因。1.从基因文库中获取目的基因要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的廿的基因，犹如大海捞针，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，概括地说，主耍有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。将某种生物体内的DNA全部提取岀來，选川适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然

3、后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体屮储仏每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种牛物的所有基因，叫做这种牛物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产牛的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一•个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。知识拓展直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法"，又叫“散弹射击法”。这种方法犹如用猎枪发射的散弹•打鸟，无论哪-颗艸粒击中目标，都能把鸟打下來。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体

4、细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有口的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫、抗病毒的某凶都可以用上述方法获得。用“鸟枪法”获取目的基因的缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又市于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成基因的方法。2•利用PCR技术扩增目的基因20世纪80年代以后，随着DNA核昔酸序列分析技术的发展，人们已经可以通过DNA序列自动测序仪对提取出来的基因进行核

5、昔酸序列分析，并口通过一种扩增DNA的新技术（也叫PCR技术），使目的基因片段在短时间内成百万倍地扩增。上述新技术的出现大大简化了基因工程的操作技术。难点剖析PCR扩增是获取H的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR反应包括以下几个主要过程：第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核甘酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90〜95°C,使双链DNA模板两条链Z间的氢键打开，变成单链DNA,作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至55〜60°C,使两种引物分别与模板DNA链3,端的互补序列互补

6、配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至70〜75°C,在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核甘酸加到引物所提供的3—OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着垂复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。知识拓展目的基因在表达载体屮得到表达并发挥作川，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由：（1）牛物Z间进行基因交流，只有使用受体牛物口身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。（2）通过

7、cDNA文库获得的口的棊凶没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录。（3）1=1的基因是否导入受体牛物中需耍有筛选标记。（4）为了増强目的基因的表达水平，往往述要增加一些其他调控元件，如增强子等。（5）有时需耍确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往耍加上对以标识存在部位的基因（或做成目的棊因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。二、基因表达载体的构建将1=1的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA$新组合的过稈。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个切口，露出黏性末端。然后川同一种限制酶切断II的基因，使其

8、产生相同的黏性末端。将切下的II的基因的片段插入到质粒的切口处，再加入适塑的DNA连接酶，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成了一个mDNA分子。例如，人的胰岛素基因就是通过这种方式与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫車组质粒）的。除了H的基因，构建基因表达载体，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。疑点突破在构建基因表达载体吋，主要考虑以下儿方而的因素：（1）基因的特点：如果一个来口动物的1=1的基因含有内含子，就不能用于转基因植物,因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基