第二章 基因工程工具酶

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1、第二章基因工程工具酶分类：限制性内切酶（RestrictionEndonuclease）RNaseA1.水解酶类核酸酶RNaseT1RNaseHDNaseⅠS1核酸外切酶（Exonuclease）（内切酶）大肠杆菌DNA聚合酶（DNAPolⅠ)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（KlenowFragmentⅠ）2.DNA聚合酶类嗜热DNA聚合酶（Taq酶）DNA连接酶(Ligase)反转录酶（ReverseTranscriptase)小牛肠碱性磷酸酶(CIP)3.修饰酶类细菌碱性磷酸酶(BAP)T4噬菌体多核苷酸激酶（T4PhagePolynucleotideK

2、inase)鼠源禽源（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（四）II型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内切酶的消化反应条件第一节限制性核酸内切酶由寄主控制的限制和修饰现象---20世纪60年代，Linn和Arber发现(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌KEOP=1EOP=1EOP=10-4EOP=10-4EOP成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA（一）限制性核酸内切酶的发现限制和修饰现象（在原核生物，少数霉菌和蓝藻中。）在核酸分子链的内部制造切口E.coliB含有EcoB核

3、酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。限制—修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰基因组DNA不被切割细菌的限制和修饰系统是一种自我保护作用。1962年，瑞士的W.Arber提出细菌的限制修饰系统。1968年发现Ⅰ型核酸内切酶;1968年，

4、美国的H.O.Smith发现Ⅱ型核酸内切酶；1970年，美国的O.Nathans用Ⅱ型核酸内切酶制备了肿瘤基因。1978年三人共获诺贝尔生理与医学奖。从此，相关研究展开。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。概念:限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3,5——磷酸二酯键。重点（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基

5、因克隆中I型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5‘端至少1000bp不是（随机）无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+位于识别位点上是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是用处不大重点思考粘性末端cohesiveends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端Bluntend在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。（三）限制性核酸内切酶的

6、命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。EcoRⅠ（酶名称）:EscherichiaColiRnisⅠ属名种名株系编号（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4~8个核

7、苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。能识别外源DNA并将其水解的内切核酸酶，是细菌对外源DNA的防御机制。几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd4.不具有甲基化功能II型限制性核酸内切酶的甲基化修饰作用由相应的甲基化酶承担。5.对单链DNA的切割切割效率较低。酶活单位一个限制酶单位（U）

8、指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，多数是37℃，少数是