蛋白浓度测定

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1、北京科技大学生物技术专业必修课课程论文课程名称：生物化学实验作者：黄凯辉论文题目：分光光度法和考马斯亮蓝法测蛋白质浓度分光光度法和考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度黄凯辉北京科技大学生物技术系摘要：测试了两种测定溶液中可溶性蛋白质含量的方法。利用胎牛血清蛋白为标准蛋白,通过考马斯亮蓝和紫外分光比色法分别建立标准曲线，适当稀释未知蛋白测其吸光度，并使吸光度落在标准曲线区间内，从而得到未知蛋白质样品浓度；并探讨以鲱鱼精DNA为干扰因子对实验结果的影响。结果表明：考马斯亮蓝法标准曲线：Y=30.779X-0.0094，线性相关度为0.9989，对应胎牛血清蛋白浓度区间为0.014—0.024m

2、g/mL，。紫外分光光度法：Y=1.1337X+0.0062，线性相关度为0.9997，对应蛋白浓度区间为0—0.5mg/mL。相比之下考马斯亮蓝法更灵敏，紫外分光光度法对干扰因素更敏感关键词:考马斯亮蓝法;紫外分光光度法;蛋白质浓度背景：蛋白质是生命活动的基础物质,是构成人体新生组织、维持人体健康的重要成分,它具有许多生物学功能;蛋白质作为人体最重要的营养素之一,它的分离与定性、定量分析是食品、药学和生命科学研究中经常涉及的重要内容,也是生物化学和其他生物学科、食品检验、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。目前食品中蛋白质含量的测量方法有紫外吸收法、凯氏定氮法、福林酚比色

3、法、考马斯亮蓝法等。紫外吸收法在测定酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质时,有一定的误差;福林-酚比色法是灵敏度较高的方法之一,但是该法专一性较差,干扰物质较多,如酚类、柠檬酸、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用,且操作费时长,还要精确控制操作时间。凯氏定氮法是测定粗蛋白质的经典方法,但由于样品中非蛋白质含氮化合物的干扰,使得测定结果不能完全反映被测样品中真实蛋白质的含量。本试验采用紫外分光光度法和考马斯亮蓝比色法分别测定了未知样品中蛋白质的浓度并分别测试了鲱鱼精DNA对两种方法的干扰。旨在分析比较两种方法的优缺点，以判断不同条件下更适合的测量方法1.1基本原理紫外分光光度法：蛋白质

4、分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可进行蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成的蓝色蛋白质染料复合物,在595nm处有最大吸光度,在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质含量的测定2.1试剂与器材考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G-250100ml溶于50ml95%乙醇

5、中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸。标准蛋白牛血清蛋白，酪蛋白可选试剂：鲱鱼精DNA，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，Tris,NaCl3.考马斯亮蓝法3.1溶液的配制标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白500mg,用蒸馏水定容至50mL,配成10.mg/mol的溶液1。取1ml溶液1，用去离子水定容至10ml，配成1.00mg/ml的标准蛋白溶液。考马斯亮蓝G-250溶液的配制:精确称取考马斯亮蓝G-250100mg,溶于50

6、mL95%的乙醇,再加入120mL85%的磷酸,稀释定容至1000mL备用。3.2未知样品中蛋白质吸光度值的测定样品稀释取1000ul蛋白样品溶液，稀释至5ml，得到样品稀释液A。吸光度测定分别取10ul,12ul样品稀释液A，标记为样品1，2。加入4.0mL考马斯亮蓝G-250溶液,用蒸馏水定容至5.0mL,摇匀,以空白(4.0mL考马斯亮蓝G-250溶液+1.0ml蒸馏水)溶液作参比溶液,分光光度计595nm波长处测定样品组的吸光度。空白溶液样品1样品2稀释倍数------25002083.3样品稀释液的量/ul01012去离子水/ul1000990990考马斯亮蓝/ul40

7、0040004000吸光度值0.3570.5033.3标准曲线的确定在试管中分别精确移取牛血清蛋白标准溶液0、70、80、90、100、110、120uL,加蒸馏水至1.0mL,然后在各支试管中分别加入4.0mL考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀。空白溶液标液1标液2标液3标液4标液5标液6蛋白浓度/(mg/ml)--0.0140.0160.0180.0200.0220.024标准蛋白溶液/ul0708090100110120去离子水/ul1000930920910900890880