流式细胞术在病理诊断上的应用

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1、流式细胞术在病理诊断上的应用张尚昆（江汉人学医学院病理学与病理生理学教研室湖北武汉430056）摘要：流式细胞术（flowcytometry,FCM）是近代细胞生物学、分子生物学、分了免疫学、流体力学、激光技术、电了计算机技术等高度结合和发展的结品，是一种在功能水平上对单细胞或其他细胞粒子、抗原物质进行快速检测分析和分选的技术。FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤具适用于大量样品检测。关键词：流式细胞术；临床检验；肿瘤；免疫学1流式细胞术原理流式细胞仪的基本工作原理是采用

2、激光作为激发光源，利用荧光染料与单克隆抗体结合的标记技术，通过计算机系统对流动的单个细胞或微粒的多个参数信号进行数据资料处理，从而对忖的细胞或微粒进行详细的分析山。FCM常用的荧光染料有FITC（异硫紙酸荧光素）、PE（藻红蛋口）、PI（碘化丙喘）等，常用的标记方法为直接免疫荧光染色和间接免疫荧光染色，采用的是抗原抗体特异性结合的原理。直接免疫荧光法多用于对细胞表面标志的染色分析，选用单克隆荧光抗体，直接与相应抗原反应。每检杏一种抗原就需要制备一种荧光抗体，特异性高，缺点是敏感性偏低。间接免疫荧光法是选用

3、特异性单抗（一抗）与待测细胞结合后，再用荧光二抗（针对一抗的特异性抗体）进行标记染色，形成抗原一抗体一荧光抗体复合物后上机检测分析。此法应用广泛，最适宜检测一些新的未知抗原，进行一些研究分析。这种方法只要标记儿类种屈特异性不相同的二抗即可。由于流式细胞仪及软件系统的飞速发展，为了获取双参数或多参数数据资料，需要进行荧光抗体的组合标记，常采用二色、三色、四色甚至更多标记山。2流式细胞术在临床检验中的应用2.1FCM在临床微生物检测中的应用FACS快速、灵敏以及可以同时进行多参数分析的优点，使其在临床微生物检

4、测中的作用受到越来越多的关注。通过荧光染料标记，不仅可以检测病原菌、毒素和血清抗体，还可用于抗生素敏感性试验，对抗生素后效应、细菌耐药的异质性等进行分析。流式微球分析（CBA）技术是FACS检测细菌病原体的常用方法，微生物抗原与被异性抗体包被的荧光微球结合，由于抗原的遮蔽效应，使荧光微球的发散光减弱，通过检测发散光强度的变化来进行诊断，应用不同大小的荧光微球，可同时检测同一标本的多个病原体，这种方法也可用于真菌、寄生虫、病毒以及这些病原体混合感染的检测〔2】。FACS体外抗生素药敏试验的主要机制是，通过F

5、ACS检测染料与病原体结合后发出的不同荧光强度，间接反映病原体的活性和功能状态，进而帮助判断病原体对抗生素的反应性。用于研究抗菌效应的荧光染料主要有两人类：1.标记DNA和RNA的染料，如碘化丙I症(PI)、澳化乙锭(EB)等；2•反映代谢活性或结合蛋白的探针,包括膜电位敏感性染料、异硫氛酸荧光索(FITC)等。这些物质的选择与其激发与发射特性有关，也与抗生素的作用机制有关。2.1FCM在外周血细胞分析中的应用五分类血细胞分析仪是临床检验应用最为广泛的血细胞分析仪。根据FCM的原理，五分类血细胞分析仪将待

6、测细胞经处理或染色后压入流动室，与此同时，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流形成一定角度，这样鞘液就能包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流朿，待测细胞在包绕下单行排列，依次通过检测区域，在激光束的照射下产生散射光和激发光。这两个光源信号分别反映了细胞体积的大小和内部的信息，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换黠将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。多数血细胞分析仪将FCM与激光散射技术、多角度偏振光散射技术、荧光技术、电导/射频技术等相结合，共同用于血细

7、胞检测，从而使检测结果更加准确、可靠。如BECKMANCOULTRER全自动五分类血细胞分析仪采用其独特的V(体积法)、C(电导法)、S(散射法)联合检测方法，测试时加入溶血剂使红细胞完全破坏，对流式通道内通过的单列门细胞逐个进行三重检测以及三维分析⑶。SYSMEX五分类血细胞分析仪运用激光流式分析系统结合核酸荧光染色技术和电阻抗技术，检测时激光散射产生的前向散射光、侧向散射光用于探测白细胞体积大小、细胞内含物的情况，侧向荧光则反映细胞内DNA和RNA的含量，直流电阻抗法用于测量细胞体积人小，最后综合各个

8、测量结果，得出各类白细胞的图形和数据⑷。雅培公司的全口动血细胞分析仪运用FCM与多角度偏振散射分离技术。国产边瑞公司的血细胞分析仪结合了FCM、激光散射技术和化学染色技术⑸。2.2FCM在尿沉渣分析中的应用目前，一些全口动尿沉渣分析仪也应用了FCM,例如SYSMEXUF系列尿沉渣分析仪就是采用FCM结合荧光染色和半导体激光技术，将检测通道分为沉渣通道和细菌通道。检测尿液中的细胞成分时，首先对细胞中的特沱物质进行荧光染色并调节到