PCR污染防治手册

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1、PCR污染防治手册—X为什么要如此重视防治PCR污染？聚介酶链反hV(polymerasechainreaction,PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。扩增过程小，扩增的DNA产量是呈指数上升的。PCR产物的浓度一般为10门拷贝/ml,而lmg人基因组DNA才含1.4*106拷贝的单拷贝基因片段，因此便得PCR扩增反应的敏感性非常高。正是由于PCR反应具冇强大的扩增效率也导致其及易污染，极微量的PCR产物污染便可导致假阳性结果。在应用HPV分型试剂盒的过程小，主要存在两个污染源：1.标本间的交义污染；2.PCR扩增产物的污染。

2、其中以第二个污染源为最为常见，通过下面一个例了便可认识到PCR产物污染的严重性。在100ml的反应管中可产生10门拷贝个分子，若将这些分子在一个标准奥林肚克游泳池(50m*25m*2m)内稀释后，0.1ml稀释液含有400拷贝的扩增分子，远远超过了PCR扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，一定要注意产物残爾污染的问题，对临床实验室尤应如此。二、PCR污染的来源对于HPV分型检测试剂盒來说，污染的來源主要是PCR扩增产物的污染，常见的污染途径有两种，一是气溶胶污染，在空气与液体而摩擦吋就可形成气溶胶，在操作吋比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及受污

3、染的进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。二是PCR产物的粘带污染，此类污染多是因为没有严格遵守分区规定，造成PCR产物扩散到样品抽提或PCR实验室。实验大衣、手套、移液枪、枪头、枪头盒和试管架都是常见的粘带污染源。污染发生时，这些地方是重点怀疑的地方。三、PCR污染的追踪如果不慎发生或者怀疑有污染发生，可以设计一个简单的小实验以确认污染源。用HPV的PCR扩增系统扩增如卜•模板：A:水-一作为阴性对照，如果此管扩增出阳性，则可以判定为试剂已经污染或者是气溶胶污染

4、。B:阳性样品一-作为阳性对照,验证实验是否成功。c-x：-—所要检查的地方，用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源，0.1M去离子水浸泡后作为模板。常见的需要检查的地方为各个实验台面、移液枪、枪头、枪头盒、试管架、冰箱内、冰箱把手、水浴锅、抽提的相关试剂以及相关人员的办公桌。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，可以在室内加装紫外灯管照射过夜目.彻底通风并停止几天的实验。四、PCR污染的预防进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降

5、低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。1、划分操作区：实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行，最基木的一个原则就是PCR扩增及朵交检测区的东西是属于污染源，绝对不可以带到前两个区去。A：样甜制备区，包括扩增摸板的制备；B：PCR加样区，包括反应液的配制和PCR扩增;C：PCR扩增及朵交检测区，杂交操作过程在这个地方完成。分区的注意事项：各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备一PCR扩增〜产物分析〜产物处理。样品的保存应该在上述三个区以外单独的区域。各个区域的物品及衣服必须严格遵

6、守单向的原则。各个区域必须要自己单独的实验衣，实验时必须戴上手套。每个区域要冇自己单独的实验设备。以下是常见的分区方式：PCR加样区样品制备区PCR扩増及杂交检测区缓冲间图一PCR扩增及杂交检测区样品制备区—走廊PCR加样区图二图四图三2、实验操作的注意事项：A:戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；B:使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气屮，避免气溶胶的污染；C:避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；D:操

7、作时设立阴阳性对照和空片对照，即可验证PCR反M的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；E:尽可能用可替换或可高圧处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标木DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没冇这种特殊的加样器，至少应经常的擦洗枪外表及枪管内。3、严格对PCR产物的处理：PCR产物包括杂交产物，在读数结束后，杂交产物或PCR产物应该用一次性密闭容器（垃圾袋、自封袋）装好后丢弃或者倒至1mol/LHC1溶液或1:25的84消毒液中,浸泡半小时以上后再行丢弃。如果有产物溅在了桌面或器具上,应立即用1mol/LHC1溶液或1:2

8、5的84消毒液擦拭。4、根据实验室情况建立完善的LI常PCR防治制度并严格执行事在人为，制度执行了才能达到它应冇的效果，根据实验室实际情