气藏甲烷形成途径研究

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1、气藏甲烷形成途径研究细菌、古菌16SrRNA克隆文库的构建和分析经观察,样品水中微生物细胞含量为1X103〜IX104个/niL,估算实验需要800〜1000mL地层水。用滤膜过滤地层水，收集菌体，提取总DNAo根据提取的DNA核酸浓度(6〜Ilng/PL)计算PcR扩增的模板体积。样品扩增结果显示，扩增产物均为单一条带(见图2),这表明PcR反应无明显非特异性扩增现象出现。然后切胶回收冃的条带，根据回收16SrRNA浓度(大于20ng/uL)准确计算目的基因体积。克隆完成后通过蓝白斑筛选获得阳性克隆。依据阳性克隆测序结果，同源性大于97%的16SrRNA序列归于一个oTU。其中,杜6-3

2、井样品98个细菌克隆划分为9个oTU,古菌129个克隆划分为10个oTUo敖-7井样品105个细菌克隆划分为12个oTU,古菌104个克隆划分为10个oTUo本文获得的41个oTU序列的GenBank的登陆号为:jQ812008-jQ812048o利用软件构建细菌、古菌发育树，算法采用Neighbouring-joining方法。构建细菌和古菌克隆文库，分析地层水微生物群落结构和产甲烷菌的构成。杜6-3井样品地层水中的细菌隶属于假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜酸菌属(Acidovorax)>动性杆菌属(Planomicrobium)>节杆菌属(Arthrobacter)>白色杆菌属

3、(Leucobacter)。其中假单胞菌属微生物占％,节杆菌属微生物占％,嗜酸菌属和□色杆菌属微生物所占比例均在4%左右(见表2)o因此，假单胞菌属微生物为杜6-3井地层水中绝对优势微生物。张雪梅等和吴亚曼等在大庆油田地层水中、袁三青等在胜利油田油丿I：釆出液屮也都发现，假单胞菌属微生物为优势菌属微生物。杜6-3井样品地层水中的古菌隶属于甲烷杆菌属(methanobacterium)和甲烷鬃菌属(methanosaeta)。其屮，甲烷杆菌属微生物为杜6-3井古菌耳•的绝对优势微生物,所占比例高达％。因此，认为杜6-3井地层水中起主要作用的微生物是假单胞菌属微生物和甲烷杆菌属微生物。敖-7井

4、样品地层水中的微生物种类也较少(见表3),水中的细菌隶属于假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜氨基杆菌属(Aminobacter)、甲基营养变形杆菌属(methylotrophicproteobacterium)、§-变形杆菌属(DeItaproteobacteria)>拟杆菌属(Bacteroides)、节杆菌属(Archrobacter)>海杆菌属(marinobacter)>嗜氢菌属(Hydrogenophaga)以及古菌(Archaeon)。其中，假单胞菌属微生物占％,—种不可培养细菌占％，嗜氢菌属微生物占％。敖-7井地层水样品中的古菌属于甲烷杆菌属(methanobacter

5、ium)、甲烷食甲基菌属(methanomethylovorans)和甲烷八叠球菌属(methanosarcina)o其中,甲烷杆菌属微生物占％，为绝对优势古菌；甲烷食甲基菌属微生物和甲烷八叠球菌属微生物所占比例分别为％和％。细菌、古菌系统发育树的构建和分析1细菌系统发育树的构建和分析基于16SrRNA基因信息绘制杜6-3井地层水屮的细菌进化发育树（见图3）。系统发育树中的微生物群落划分为4个类群，分别是：B-变形杆菌纲（Betaproteobacteria）＞Y-变形杆菌纲（Gammaproteobacteria）、芽砲杆菌纲（Bacilli）＞放线菌纲（Actinobacteria）o

6、分析系统发育树发现，与Du-6-3_B13同源相似性为99%的微生物属于不可培养嗜酸菌属微生物，其GeneBank的登录号（以下简称登录号）为NR026506；由于地层水的pH值显示地层水中没有积累大量的酸类物质，因此推测微生物代谢过程屮可能产生少量的酸类物质，这些酸类物质后来被微牛物及时代谢分解。Du-6-3_B13同代谢季碳原子的已知微生物（登录号：AJ012071）同源相似性也达到99%,因此推断地层水中微生物利用坯类物质参与代谢循环。Du-6-3_Bll在菌群中占％,与其同源相似性达99%的微生物（登录号：JF727662）具有降解姪的能力，属于变形杆菌纲。与Du-6-3_B12同

7、源相似性达100%的已知菌（登录号:HQ057683）属于放线菌纲,参与碳、硫元素的循环代谢。Du-6-3_B30占菌群的％,与动性杆菌属的己知微生物（登录号:AJ697862）同源相似性达99%。综上所述，地层水小微生物利用坯类物质参与代谢循环，将小分子怪类部分转化为有机酸，但这些酸类物质迅速被嗜酸菌代谢分解，因此推测甲烷形成途径主要为co2还原途径，为乙酸还原途径的可能性较小。敖-7井地层水的细菌系统发育树(见图4)