PCR污染分析及对策

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1、PCR污染分析及对策PCR污染分析及对策污染原因：1、标本间交叉污染:标木污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放賈时,由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成郴互间交叉污染:标木核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标木间污染:有些徴生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染.2、PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪.容赂双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.3、PCR扩增产物污染•这足PCR反应中最主要最常见的污染问题•因为PCR产物拷贝堂大（一•般为1013拷

2、贝/ml）,远远离于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微厳的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.4、还有…种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液休面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管.开孟时.吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染•据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其适成的污染是一个值得转别重视的问题。5、实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验宅，这个问题也比较常见•因为克隆质粒在单位容枳内含量相当高，另外在纯化过

3、程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长緊殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.污染的监测:一个好的实验室，要时刻注恿污染的临测，考虑有无污染是什么原因造成的污染.以便采取描施，防止和消除污染•对照试验：1、阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应足否成功.产物条带位賈及大小足否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性对照要选择扩峭度中等、更复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以篁组质粒为阳性对照，其含虽宜低不宜高（100个拷贝以下）.但阳性

4、对照尤貝:是車组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样阳污染的可能性很大.丙而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.2、阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血淸就用鉴定后的正常血淸作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的纽织细胞作对照•②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以监测试剂足否污染.3、重复性试验。4、选择不同区域的引物进行PCR扩増。防止污染的方法K合理分隔实验电:将样品的处理、配制PCR反应液.PCR循环

5、扩増及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，转别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩増区;④PCR产物鉴定区•其实验川品及吸样枪应专用•实验前应将实验宅用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.2、吸样枪:吸样枪污染是一个值得注慈的何题•由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心•吸样要慢•吸样时尽量一•次性完成.忌名次抽吸.以免交叉污染或产生气溶胶污染.3、预混和分装PCR试剂:所有的P

6、CR试剂都应小量分裟，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20C保存•以减少重复加样次数，避免污染机会•另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱.4、防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.5、设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低駅的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，毎次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩増核酸的样品作阴性对照.6、减少PCR循环次数.只耍PCR产物达到检测水平就适可而止.7

7、、选择质量好的Kppendorf管，以避免样本外溢及外來核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部•开管动作要轻，以防骨内液体溅出.污染的预防：进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。1、划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的询处理和后处理要在不同的隔离区内进行：1）标本处理区，包括扩增摸板的制备；2）PCK扩増区，包括反应液的配制和P

8、CR扩增：3）产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及龜组克隆的制备各工作区要有一定的隔离,操作器材专用，要有一定的方向性。如：标木制备一PCR扩增？产物分析？产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要余到其他两个工作区。2、分装试剂：PCR扩增所需耍的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器