聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用

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1、聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K・Mullis发明，并和定点突变的发明者M.Smith-起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性(denaturation):94°C~95°C退火(annealing):40°C~70°C延伸(extension):72°C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。二、PCR的反应

2、体系和反应条件(-)PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、弓I物、dNTP、TaqDNA聚合酶和缓冲液等。1模板包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA,再以cDNA作为扩增的模板。模板量：lOOOng、500ng>lOOng.50ng...2、引物(Primers)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核昔酸片段。引物的合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。设计引物的原则:1)二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板

3、正负链序列互补2)长度为18~25个核昔酸3)二条引物之间避免形成引物二聚体4）引物的碱基组成应平衡5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）6）引物的5、端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）3、脱氧核昔三磷酸(dNTP)是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核昔三磷酸的混合物。反应体系中各种核昔酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20~200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。从一种生活在热泉（80°C~90°C）中的水栖

4、噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。Taq酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3,-0H末端加上脱氧单核昔酸，形成3’，5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5,-3,方向延伸，催化DNA合成。最适酶量:1-2.5U（酶量过多，导致非特异性扩增）TaqDNA聚合酶复制的保真性，TaqDNA聚合酶无3,-5,外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000,碱基替换率为1/8000,故扩增的片段

5、越长，错配的机率越高。耐热的DNA多聚酶有PwoDNApolymerase、TthDNApolymerase、PfuDNApolymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2~10倍。5、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核昔酸和提高Taq酶的活性有直接影响。虽然Taq酶的活性只与游离的M/浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、弓

6、物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与M尹结合而降低游离MQ的浓度从而影响酶的活性。当dNTP浓度为200umol/L时，MgC12的浓度

7、为1・5mmol/L较宜。6、其它反应因素pH：调节至酶反应所需的最适pH（pH二7.2左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq酶的活性）（-）PCR的反应条件反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度变性温度：94~97°C退火温度：低于引物Tm5°C左右。温度过高会降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高

8、的酶促活性。2、时间第一次变性应给予足够时间（5~7分钟）。每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~1分钟，时间过长易导致非特异性扩增3、循环次数重复次数一般设为25〜35个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的D

9、NA片段间的竞争等。三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应区、产物分析区PCR技术的质量保证:基因扩增检验的全过程的质量保证室内质量控制和室间质量评价防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP,再加入尿喘腱糖昔酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质