实验六 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量(预习报告)

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1、精品文档就在这里-------------各类专业好文档，值得你下载，教育，管理，论文，制度，方案手册，应有尽有----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------生物化学实验预习报告实验六SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量一、研究背景电泳技术的发明是人们在分离纯化技术中的“差

2、异转换”思路上一次伟大的飞跃，在实际应用的过程中，人们发现了它在大量样品纯化上的劣势以及分析上的突出优点，进行“扬长避短”，最终将其作为生物大分子分离鉴定的常用技术而被保留与发展下来。自电泳技术发明以来，生命科学领域迅猛发展，人们对生物大分子的研究不能仅仅停留在分离、纯化、鉴定这些宏观操作上，需要确定它们的分子量进行更加深入的研究，所以迫切需要一种新技术能够测定像蛋白质这样的生物大分子的相对分子质量。人们又把目光转移到迅猛发展的电泳技术上来，试着去寻找突破口。在之前的非变性电泳技术中，生物大分子得以分离的基础是基于三方面的差异，即分子质量

3、、分子大小与形状、电荷性质。如果要测定种生物大分子的分子质量，直接测定难度很大，这就需要首先找到一个参照标准（标准蛋白），在待测蛋白与标准蛋白之间进行“差异缩小”，将他们在电场中泳动速度的大小仅仅体现为分子量上的差异，再通过寻求某种线性关系就能得到蛋白质样品的分子质量。此外，人为地借助其他物质处理来缩小这些差异也就意味着破坏蛋白质的原有结构，变性电泳便成了必然。这一步是整个技术的核心，也是最难的突破的。1967年，Shapiro年首次报告了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，根据他对11种蛋白质电泳获得的结果，发现蛋白质（或亚基）分子量的对数

4、与蛋白质分子的迁移率之间有直线关系。随后，Weber等人进行深入研究，肯定了Shapiro的发现，确立了以连续的磷酸盐系统作为电极缓冲系统的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的新方法。后来，Laemmli将SDS电泳和Davis的不连续盘状电泳结合起来，设计出了不连续的SDS-Tris-甘氨酸系统。[1]由于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好、微量、设备简单、价廉和操作容易、迅速等优点，因而得到了迅速的发展和广泛的应用，目前已成为蛋白质研究的有力工具，广泛地应用于分子生物学、生物化学、遗传学、病理学、微生物学和植物

5、生理学等学科的研究中。在本次实验中，我们采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tris-甘氨酸系统）测定蛋白质分子量，体会学习这一技术的发明历程、原理及操作。二、研究目标1.体会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的发明历程；2.进一步学习和掌握垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与方法；3.学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。三、研究策略1.同时对蛋白质样品和标准蛋白进行处理，消除他们在形状以及电荷量上的差异，仅剩下分子量的差异；-----------------------------------------------------

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7、---------------2.将处理后的样品和标准蛋白在相同条件下进行电泳，他们的迁移速度不同，经过一段时间后，会体现出迁移距离上的差异。3.分析相对迁移率和蛋白质分子质量之间的关系，作出图像，计算样品蛋白的相对迁移率，从图像上直接得出它的分子质量。四、研究方案及可行性分析1.研究方案SDS（十二烷基硫酸钠，sodiumdodecylsulfate）是一种很强的阴离子表面活性剂，它以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的SDS-蛋白质复合物。SDS和蛋白质的结合是高密度的，其重量比通常为1.4:1，由于这种高密度的结

8、合，新引入的净电荷远远超过蛋白质分子原有的净电荷，从而消除或极大地降低了不同蛋白质分子之间原有净电荷的差异，即消除了由于各种蛋白质所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。SDS-蛋白质复合物具有均