生化鉴定方法

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1、微生物的生化鉴定微生物生化鉴定微生物在代谢过程中，由于各自独特的酶系统，其分解与合成代谢产物各不相同。这些代谢产物各具不同的生化性质，利用生物化学的方法测定这些代谢产物、代谢方式和条件等来鉴定细菌的类别、属种，称之为生化试验，也称生化鉴定。微生物分类鉴定的生理生化特征生化鉴定中依据的微生物的生理特征有：需氧性温敏性噬盐性与宿主的关系生活史等生化鉴定中依据的微生物的生化特征有：营养类型对碳源的利用能力对氮源的利用能力对生长因子的需要对抗生素及抑菌剂的敏感性代谢产物对pH的适应性等生化鉴定注意事项待检菌应是纯种培养物待检菌应是新鲜培养物遵守观察反应的时间必要的对照试验注意提高阳性检出率等试验中至

2、少挑取2-3各待检的疑似菌落分别进行试验。微生物学检验细菌鉴定的生化试验糖（醇）代谢试验氨基酸和蛋白质的代谢试验碳源和氮源利用试验酶类试验抑菌试验Ⅰ.碳水化合物的代谢试验糖（醇）类发酵试验甲基红试验（MR）V-P试验1.糖（醇）类发酵试验是鉴定细菌的生化试验中最主要的试验原理：不同种类细菌含有发酵不同糖类的酶，因而对各种糖类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖类，其代谢产物可因菌种而异。方法：在基础培养基中加入特定糖（醇、苷）类。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥

3、。结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。应用：可以用来检查细菌对培养基中所含糖降解后产酸或产酸产气的能力，因此常用以鉴定细菌种类。导管气泡培养基未变色、无气泡产生培养基变为黄色阳性阳性阴性对照2.甲基红（MR）试验应用：甲基红试验通过指示剂的显色反应可判断菌种为阳性还是阴性，常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别。原理：阳性菌包括大肠埃希菌、沙门菌属和变形杆菌属等，分解葡萄糖后可生成大量丙酮酸，丙酮酸分解后又可生成醇、醛、酮、气体和水，反应后Ph≤4.5甲基红指示剂显红色。阴性菌则包括

4、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属等，分解葡萄糖后生成少量丙酮酸，丙酮酸分解后又可生成甲酸、乙酸和琥珀酸，反应后Ph＞5.4甲基红指示剂显桔黄色。方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。结果：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。MR+MR-3.VP（Voges-Proskauer）试验原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物,即V-P试

5、验阳性。应用：主要通过测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力鉴别大肠埃希菌和产气肠杆菌，常与MR试验一起使用。方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml400g/LKOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。阳性阴性Ⅱ.氨基酸和蛋白质的代谢试验吲哚试验苯丙氨酸脱氨酶试验氨基酸脱羧酶试验尿素酶试验1.吲哚（靛基质）试验原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对位二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰

6、吲哚。培养基：蛋白胨水培养基。方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养24～48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。靛基质+吲哚（靛基质）试验原理及照片2.苯丙氨酸脱氨酶试验原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35℃培养l8～24h，滴加10％三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下。结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时问会引起褪色。应用：主要用于肠杆菌科细菌

7、的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。出现绿色+加氯化铁试剂3.氨基酸脱羧酶试验原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱。使指示剂显示出来。培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。方法：将被检菌分别接种于赖氨酸培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于35℃培养l～4d，每日观察结果。结果：对照管应呈