高效液相色谱法－仪器2

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1、3.分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm，柱长为10~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。色谱柱是色谱仪的起分离作用的关键部件，其核心是优质的色谱填料。进行特定的色谱分离工作的首要要准备性能良好的色谱柱，即选择在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。色谱柱柱结构柱材料与柱规格柱维护与保养柱性能检测保护柱柱结构柱材料柱材料最常用316#和314#不锈钢,　但有时也采用工程塑料、氟塑料和内衬玻璃不锈钢管等特殊材料。筛板一般采用耐化学腐蚀的烧结不

2、锈钢制成，孔径应小于填料粒度。连接进样阀和色谱柱以及色谱柱与检测器的导管通常采用内径为0.13mm的窄心管柱规格死体积输送分离检测进样泵进样阀柱淋洗液显色剂反应管排放加压Fe3+Cu2+Ni2+Zn2+Co2+Mn2+Fe2+Cd2+UV/VIS检测器记录柱温控制在高效液相色谱分析中，温度的影响往往容易被忽略，现随分析样品复杂性和多样性的不断出现；人们对分析结果准确度和精密度的要求不断提高，柱温的控制日益受到人们的重视。在以下几种情况需精确控制柱温：在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性。必须通过改变柱温来提高分离效率。对高分子化合物或粘

3、度大的样品，分析时柱温必须高于室温，对一些具有生物活性的生物分子，要求分析时柱温应低于室温对某些组成复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离，要使用二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温下操作以实现多组分的完全分离。一个理想的HPLC柱温控制系统，如HP1100高效液相色谱仪可以实现从低于室温10℃至80℃柱温的精确控制。对凝胶渗透色谱仪其柱温可从室温至150℃实现精确控温。柱维护与保养避免压力和温度的急剧变化及机械震动使用适宜的流动相（尤其是pH)避免将复杂样品直接进样经常用强溶剂冲洗色谱柱保存时将柱内充满合适液体，拧紧柱接头，绝对禁止

4、将缓冲溶液留在柱内过夜柱性能检测柱效：理论塔板高度峰对称性：峰不对称因子：应小于或等于1.2B(10%h)Af=A(10%h)保护柱保护柱：在分析柱入口端加5~50mm与分析柱固定相相同的短柱，吸留过滤流动相及样品中的有害组分，可经常更换，起到保护延长分析柱的作用，加保护柱虽然柱效有所损失，但在经济和实用方面是有益的。保护柱使用要点选用与分析柱同样种类但粒度大的填料不同厂家的产品存在差异，尽量使分析柱和保护柱的填料来自于同一厂家保护柱与分析柱之间的距离尽量短保护柱只是保护分析柱，不能取代样品处理定期更换保护柱保护柱不能重复使用，分析柱，尤其是反相柱

5、需要定期清洗何时更换保护柱压力增高柱效降低、分辨率降低，对称性变差基线漂移、出现鬼峰、双峰等4.检测器检测器是色谱仪的眼睛，装在色谱柱的出口用于连续检测流出液的样品组分。检测器实际上是一种换能装置,即将流动相中组分含量的变化,转变成可测量的电信号(通常是电压),然后输入记录器。从原理分析，任何一种分析鉴定方法都可能色谱检测器。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。检测器紫外检测器示差折射检测器荧光检测器电化学检测器紫外检测器紫外吸收检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为

6、微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10L。具有灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度不敏感等特点，它是液相色谱最常用的检测器。HPLC分析中，约有80%的物质可以用紫外吸收检测器检测。。在实际工作，紫外检测的主要参数是选择检测波长，它应考虑溶质和流动相的吸收特性，在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长固定波长型可变波长型二极管阵列固定波长型结构紧凑造价底操作维修方便灵敏度高适用于梯度洗脱可变波长型紫外可见分光选择性大二极管阵列同时检测全波长的信号定量的同时也可光谱定性波长可的松氟美松皮质

7、酮快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图示差折射检测器示差折射检测器是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感(0.00X℃），且不适于梯度淋洗。光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电

8、转换记录仪放大器遮光板荧光检测器荧光检测器是一种很灵敏的,有选择性的检测器,其灵敏度比UV高10~1000倍,一般可测pp