苦霉素类似物抗生素的合成

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1、苦霉素类似物抗生素的合成组合生物合成法ContentsConcepts1、CombinatorialBiosynthesis2、PKS3、PKDesignofexperiment1、labstage2、industrializationstage组合生物合成CombinatorialBiosynthesis在了解微生物生物合成途径以及克隆有关生物合成、调节等基因的基础上，在体外对这些不同来源（种内或种外）的基因进行删除、添加、取代以及重组，然后导入到一个适当的微生物宿主中并定向合成所需的一系列化合物。组合生物合成技术是在基因水平上由微生物合成各种各样的化合物，

2、其研究是建立在化合物已知的生物合成途径的基础上，通过对产生抗生素微生物的次生代谢产物合成途径中涉及到的一些酶的编码基因的操作，来获得可能具有生物活性的衍生物或具有新结构的已有药物类似物。PKSⅠ类PKSⅡ类PKSⅢ类PKSⅠ类PKS主要由酮基合成酶（KS）、酰基转移酶(AT)、脱氢酶(DH)、烯酰还原酶(ER)和酰基载体蛋白(ACP)等功能域组成。KS、AT、ACP是链延伸反应的“最小PKS”，延伸完成的长链由硫酯酶(TE)功能域催化环化成红霉素的前体6-脱氧红霉内酯B(6-DEB)Ⅱ类PKS是含有一组可重复使用单元的多酶复合体，其催化链的延伸使之成为一个很长

3、的中间体，然后通过区域专一性的催化形成芳香族聚酮化合物，如四环霉素Ⅲ类PKS是一种可重复使用的同源双亚基蛋白，在不需要ACP的情况下直接催化泛酰辅酶A间的缩合，只要合成单环就能使双环芳香类聚酮化合物的生物合成成功。现在我们所提到的PKS多指Ⅰ类PKS。目前研究比较多的PKS有苦霉素（Pik）、泰乐霉素（Tyl）、6-脱氧红霉内酯（DEBS）等的PKS，其中尤以PikPKS的研究较多。聚酮类化合物聚酮化合物是一大类由细菌、真菌和植物将低级羧酸通过连续的缩合反应产生的天然产物,它包括许许多多具有抑制细菌（如红霉素、四环素)、真菌（如灰黄霉素、性霉素)、生虫（如av

4、ermectin、马克两寄奈丁)、癌症（如多柔比星、enediynes)等活性的化合物,有些抗真菌聚酮化合物同时还具有免疫抑制剂的活性FK506,它被广泛地应用于医药、畜牧（如雷帕霉素）和农业。如今,这一化合物越来越为人们所重视,这主要是由于该化合物具有：(1)无可比拟的生物学活性使之具有巨大的新药物开发潜力和商业价值,聚酮化合物所形成的药物已用于几乎所有重要的疾病治疗,每年的销售额超过了100亿美元;(2)独特的结构和合成机制为人们研究酶催化的分子机制、分子识别和蛋白质的相互作用提供了空前的契机;(3)聚酮合酶所具有的可塑性可以使人们方便地通过组合生物合成手

5、段来获得新的化合物。目前已发现了不少于10000种聚酮化合物,而由之衍生出的新产物更是难以记数。labstage（一）制备委内瑞拉链霉菌感受态细胞挑取适量委内瑞拉链霉菌，并将其培养成单菌落，再取所得到的单菌落菌株，利用CaCl2溶液进行处理，改变内瑞拉链霉菌细胞膜的通透性，使其成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞，并置于-70℃下保藏备用。（二）合成新的PKS基因1、选取合适的PKS系统（委内瑞拉链霉菌的Pik系统）委内瑞拉链霉菌的Pik系统中，三种关键的酶和其独特的基因簇体系使这个紧凑的系统能产生多种大环内酯抗生素。最重要的是，PikAⅢ和PikAⅣ作为

6、独立的蛋白质的出现和TE“域”能使聚酮链在两个不同的位点终止，从而产生两种不同大小的环系（12和14元环）；其次，Pik系统中的糖基转移酶DesⅦ能接受12和14元环两种环系作为底物进行糖基化反应；最后一点，PikC，即P450羟化酶，具有很强的底物和化学区域特异性，从而使这一系统呈现多样性。由18个基因产生的少于60kb的DNA能产生四大类的活性大环内酯抗生素，Pik系统是学术界认为的至今为止最简单但最实用的模块PKS系统。2、合成新的PKS基因取上述保藏备用的内瑞拉链霉菌感受态细胞，以委内瑞拉链霉菌的PiK系统为模板，利用组合生物合成技术，把其编码PikA

7、Ⅳ的基因敲除,然后通过热激处理将泰乐霉素的TylGⅤ基因利用质粒为载体，转入PikAⅣ基因已敲除的委内瑞拉链霉菌中，并保证PKS基因能够在委内瑞拉链霉菌中自主复制，并实现PKS基因的转录和表达，从而实现利用委内瑞拉链霉菌生产苦霉素类似物。（三）配置筛选培养基配置含有一定量苦霉素类似物的LB培养基，将经上一步处理过的菌液涂布于该培养基上，培养一段时间，筛选出已转化的含PKS基因的委内瑞拉链霉菌。（原因：成功转化的委内瑞拉链霉菌具有PKS基因，所以能在含苦霉素类似物的培养基中生长，而未成功转化的委内瑞拉链霉菌则不能生长，所以可以用含苦霉素类似物的LB培养基筛选出已

8、转化的含PKS基因的大肠杆菌。）ind