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《家蚕BmAGO1基因的克隆、表达分析及其结合RNA的分离与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、家蚕BmAGOl基因的克隆、表达分析及其结合RNA的分离与鉴定高珍1,2,洪叶挺1,2,周芳1,2,陈健1,2,吕正兵1.2,张耀洲1,2,聂作明1,2(1.浙江理工大学生命科学学院生物化学研究所，杭州310018；2.浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，杭州，310018)摘要：RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)是一种包含Argonaute(AGO)等蛋白的核糖核蛋白复合物，其能结介成熟microRNA(miRNA),介导mRNA靶标基因的转录后基因沉默或降解
2、，从而参与基因的表达调控。AGO家族蛋白是RISC复合体的核心，是miRNA功能途径中的关键蛋门，其能够结合miRNA以及剪切靶标基因，在生物的生长发育过程起重要的作用。同时，利用AGO蛋白抗体免疫沉淀分离其结介RNA是目前规模化分离鉴定miRNA靶基因的主要方法，其研究已经备受关注。本研究通过对家蚕cDNA文库的筛选获得了一个编码Argonautel蛋白的cDNA序歹U，命名为BmAGOl,并确处英抗原表位区Kago-1,构建重组表达质粒pET-28a(+)-Kago-l,然后在人肠杆菌BL21(DE3)中表达并利用纯化
3、的重纟II蛋白免疫新西兰兔获得抗体。Westernblotting检测该基因在家蚕不同发育时期和不同组织的表达水平，结来显示发育时期中蛹期表达量最高，组织中头和皮表达量最高。由于AGO蛋白为miRNA功能途径的关键蛋白，上述表达谱分析农明家蚕蛹期与五龄幼虫的头和皮纽织屮的基因农达可能存在较为活跃的miRNA调控。因此提取头和皮组织总蛋口，川制备的多抗免疫共沉淀得到RNA/BmAGOl蛋口复合物，Trizol法提取得到结合RNA,以家蚕潜在miRNA靶基因BmEm4、Bm(spl)-like和BmEmc为测试MW,经过荧光定
4、量PCR鉴定发现，和提取的组织总RNA相比，BmEm4、Bm(spl)-like和BmEmc基因在家蚕BmAGOl结合RNA中的富集倍数分别为3.52倍、1.56倍和0.75倍。莫中前期研究显示，BniEm4基因的3，UTR存在保守的iniR-7和miR-79结合位点，这进一步证实了BmEm4为miRNA调控靶基因。目前还没冇家蚕miRNA靶基因鉴定的和关工作，BmAGOl结合RNA的有效分离为家蚕miRNA靶基因的规模化鉴立打下基础。关键词：分子生物学；家蚕；BmAGO1基因；表达谱分析；免疫共沉淀；结合RNA中图分类号
5、：Q71Molecularcloning,ExpressionprofilingofBmAGOlgeneinsilkwormandtheidentificationofitsbindingRNAGaoZhem,2»HongYetingi,2,ZhouFangi,2,ChenJiam,2,LvZhengbingi,2,ZhangYaozhoui,2,NieZuomingi,2(1.1nstituteofBiochemistry,CollegeofLifeScience,ZhejiangSci-techUniversity,H
6、angZhou,31()018;2.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofSilkwormBioreactorandBiomedicine,HangZhou310018)Abstract:RNA-inducedsilencingcomplex(RISC)isaribonucleoproteincomplex,whichcontainsArgonaute(AGO)protein.RISCcanbindmaturemicroRNA(miRNA)andmRNAofitstargetgene,resul
7、tingingenesilenceordegradationinpost-transcriptionallevel,andthusparticipateinregulationofgeneexpression・AGOfamilyproteinsarethecoreofRISCcomplexandthekeyproteinoffunctionalmiRNApathway,whichcanbindmiRNAandcutitsbindingtargetgenesandplayanimportantroleinthebiologi
8、calprocessofgrowthanddevelopment.Presently,theisolationofAGO-bindingRNAbyimmunprccipitationisbecomingthemain基金项H：国家863计划课题：家蚕生物反应器蛋白质药物规模化制备技术平台(NO.2011
