重组质粒的构建转化筛选和鉴定

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1、转化及转化子的鉴定11243224周雨一.感受态细胞的制备1、材料:E.coliDH5«菌株:R~,M~,Amp~；pBS质粒DNA:购买或实验室自制,eppendorf管。2、设备：恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计,微量移液枪。3、试剂：LB固体和液体培养基，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，麦康凯培养基（MaconkeyAgar）,0.05mol/LCaC12溶液,含15%甘油的0.05mol/LCaC12。4、受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5

2、a单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37°C下振荡培养12小吋左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37°C振荡培养2-3小时至00600=0.5左右。5、感受态细胞的制备（CaC12法）将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟,然后于4°C下3000g离心10分钟。弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaC12溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后,4°C下3000g离心10分钟。弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaC12溶液,轻轻

3、悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200u1的小份，贮存于-70°C可保存半年。二、转化1、DNA和感受态细胞都置于37度恒温水浴锅中激活，然后将DNA转移到感受态细胞悬液中，反复吹打，使其均匀接触（由于细菌可以从环境屮直接吸收DNA）；2、运用热胀冷缩的原理，将混悬液放在冰水浴中半个小时到40分钟（最短时间），使得DNA与细胞表面受体结合；3、轻轻的将混悬液置于37到45度的水浴锅45秒；4、平稳快速的转入冰水浴中2分钟；5、取出，加入900ul的37°C预热的LB培养基，混匀；6、放入37度的培养箱1小时

4、，让菌苏醒，恢复生长；7、取适当离心（3000至4000r/min,lmin,弃部分上清液200微升）的管中细胞均匀地接种在选择培养基（LB培养基+某种抗生素）；久提前一天进行抗生素平板，培养基灭菌，之后，加入抗生素（青芻素），分布均匀，冷却至60度以下，适当摇瓶，摇着冷却，混匀后，涂平板，冷却凝固，再放入冰箱充分凝固，再在37度培养箱1小时，烘干水，离心，3000-4000r/min1min,去上清；9、挑选部分的菌落，至少5个（随机）单菌落，进行扩大培养，以便于鉴定；10、将菌作为PCR模板进行扩增（菌落PCR）；11、进行菌种保藏

5、，在液体培养基上；12、再将菌种送到公司测序，如果是碱基突变、引起氨基酸变化等，就需要重新开始做。二、转化子的筛选鉴定(一)菌落PCR鉴定重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各

6、种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，a互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PET28a携带有氨节青霉素抗性基因(Amp1)，在含有氨节青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PET28a的受体细胞，在含有氨节青霉素的平板上不生长。质粒PET28a进入E.coli0157:H7后，通过a-互补作用，形成完整的B-半乳糖昔酶。

7、在麦康凯培养基平板上，转化子利用半乳糖昔酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coli0157:H7,没有B-半乳糖昔酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集小的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨节青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PET28a乳糖利用基因内部，不能形成a-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨节青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。挑选在氨节青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增

8、培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨节青霉索培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子屮重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，