仪器分析讲稿(第3章液相)

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1、第三章高效液相色谱分析（HPLC）§3.1高效液相色谱的特点一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。高效液相色谱是20世纪70年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离技术。（液相色谱+气相色谱理论+高压泵、高效固定相+高灵敏检测器）。二、特点1.高压:可达150～350×105Pa2.高速:例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20多小时，用HPLC只需1小时.3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米）4.高灵敏度：紫外检测器10-9g；荧光检测器10-11g三、应用范围气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物

2、、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70-80%。。因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，不受试样挥发性的限制。§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素与GC比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致；主要区别：流动相不同.液相色谱中对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素：一、柱内展宽1.涡流扩散项：He=2λdpλ:填充不均匀因子

3、；dp填充粒度直径高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱，填充很均匀，λ变得很小，所以He值比较小。2.纵向扩散项65/-1：Hd=CdDm/u；当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时，由于分子本身运动所引起的纵向扩散同样引致色谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数Dm比在气体中小4-5个数量级，在LC中可忽略,GC中重要。3、传质阻力项组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡，从而引起峰扩展。（1）固定相传质阻力项（主要发生在液－液分配色谱中）当流动相中的试样分子扩散进入到涂渍在载体表面的固定液内进行质量交换时，由

4、于渗入固定液膜的深度不同，其返回到流动相中的时间也不同，因而引起峰扩展。采取措施：1）液-液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。2）采用扩散系数大的液相固定相。3）减小流动相的流速，改善传质。（2）流动相传质阻力项(二种形式:在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质)i.流动的流动相中的传质阻力项Hm当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，移动速度不一样从而引起峰形变宽。ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内的流动相称为滞留区流动相（静止状

5、态，不流动）。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：H=A+B/u+Cu由于B/u这一项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项，高效液相色谱的方程可写成：H=A+Cu提高柱效的方法：（1）减小固定相的颗直径，可明显提高柱效；（2）降低流动相粘度或提高柱温，可增大Dm；（3）在一定范围内减小流速，有利于于减小H；（4）提高装柱技术，提高柱内填充料的均匀性而减小A项。1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分

6、布均匀的球形固定相（dp≤10μm,5μm目前应用最广泛）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min3.柱温的选择：选室温25℃左右HPLC法中分离条件的选择HPLC与GC的H-u曲线见图3-1：（1）两者曲线形状相似，都有一个H最小值；（2）HPLC的H最小值比GC的最小值小一个数量级以上，柱效更高；（3）HPLC的最佳流速u比GC的最佳流速u也小一个数量级以上。二、柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩展.a.柱前展宽：主要由进样所引起；进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或注入进样器的液流中。由于进样器

7、的死体积以及进样时的液流扰动引起色谱峰不对称和展宽。解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心1~2mm处。b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起.解决：连接管的体积、检测器的死体积应尽可能小.§3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型：液-液色谱；液-固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱1.特点：a.流动相和固定相都是液体b.两相应互不相溶，有明显的分界面2.分离机制：试样组分溶于流动相后,在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，溶质在两相间进行分配。K=cs/cm=kV