生物工业分析 第6章 色层分析法

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1、生物工业分析第六章　色层分析法第一节　概述第二节　柱层析第三节　纸上层析第四节　薄层层析第五节　凝胶层析色层分析法第一节概述色层分析法简称层析法，也称色谱法、层离法等。①按两相所处的状态分类：用液体作为流动相的称为“液相色谱”，用气体作为流动相的称为“气相色谱”。考虑到固定相的物态，液相色谱又分为“液液色谱”和“液固色谱”，气相色谱又分为“气液色谱”和“气固色谱”。②按固定相使用形式分类：可分为柱层析、纸层析、薄层层析。③按分离过程的物理化学性质分类：可分为分配层析、吸附层析、离子交流层析、凝胶层析、亲和层析等。④按洗脱方式分类：可分为洗脱法、迎头

2、法、置换法。色层分析法第二节　柱层析一、吸附柱层析1．原理吸附层析是利用吸附剂对不同物质吸附力的差别而达到分离的方法。图6-1　二元混合物的柱层析图色层分析法吸附柱层析的过程可简要说明如下：装置如图6-1⑴，用一根玻璃管，底部放些棉花或玻璃纤维，管中填入吸附剂（如氧化铝的粉末），这样就形成了一个吸附柱。然后在顶部加入待分离的样品溶液，设样品内含有两种组分A和B，则两者都被吸附剂留在柱的上端形成一个色带。图6-1⑵⑶，图中的虚线是溶液中溶剂前沿到达的地方。样品溶液全部流入吸附柱中后，接着就加入纯溶剂冲洗，管内就连续不断地发生解吸、吸附、再解吸、再吸附

3、的过程。例如被吸附的A组分被溶剂所解吸而随溶剂向下移动时，又遇到新的吸附剂颗粒，重新把A自溶液中提出而被吸附，当继续流下的新溶剂再次把A解吸向下移动，然后再被吸附，这样经过一段时间以后，A就会向下移动至一定距离。同理B也向下移动，由于溶剂及吸附剂两者对A与B的角吸力与吸附力不同，A与B所移动的距离也就不同。吸附力较弱的与解吸力较强的组分（如A），移动距离也就大些，经过适当时间以后，A和B就可以安全分开，形成两个区带，每一区带内是一种纯物质。如果A与B有颜色，就可清楚地看到色带，如图6-1⑷⑸。加入的溶剂称为“洗脱剂”，冲洗过程称为“洗脱”或“展开”

4、，管下流出的液体称为“流出液”或“洗脱液”。色层分析法2．流出曲线图6-2　不同洗脱方式的流出曲线色层分析法①洗脱法流出曲线如果洗脱剂采用纯溶剂，并连续不断地洗脱，最初流出的为纯溶剂，尔后是吸附力较弱的组分A，最后为吸附力较强的组分B，得到的流出曲线见图6-2⑴。洗脱法优点是分离效能高，能得到纯组分溶液，适用于多组分混合物的分离，它是目前层析法中最常用的方法。②迎头法流出曲线如果洗脱剂为原试样溶液，则最初流出的为纯溶剂，当流过一定体积的试样溶液后，吸附力较弱的组分A在吸附柱中被饱和，组分A就开始流出，其浓度要比原试样溶液中组分A的浓度为高。紧接着吸

5、附力较强的组分B在吸附柱中被饱和，组分B也开始流出，此时收集的流出液组成与原试样溶液完全相同，见图6-2⑵。迎头法只能得到较纯的组分A，它不是一个理想的分离方法，仅用作混合物的分析研究之用。色层分析法③置换法流出曲线如果洗脱剂是一种溶液，内含有吸附力更强的组分，称为“置换剂”，同样道理，得到的流出曲线为图6-2⑶。置换法能达到组分A与组分B分离的目的，但临接部分则互相混杂。3．吸附剂能作为吸附剂的，需满足下列要求：①吸附剂要具有合适的吸附力，表面积大，通常呈粉末状或纤维状。②吸附剂颗粒均匀，否则不能得到均一的色层谱。③吸附剂与吸附物质的吸附、解吸应

6、是可逆的。④吸附剂不应含有杂质，否则需经预处理后使用，通常可用有机溶剂浸泡以除去杂质。色层分析法用作吸附剂的材料很多，可分为无机吸附剂与有机吸附剂，常用的无机吸附剂有氧化铝、碳酸钙、氧化钙、氧化镁、氧化锌、磷酸氢钙、硅酸、活性炭等。有机附吸附剂有蔗糖、乳糖、淀粉、菊根粉、纤维素等。按其吸附力的大小分为弱、中、强三类，见表6-1。表6-1　吸附剂按吸附力分类色层分析法4．洗脱剂洗脱剂的选择一般需要考虑以下几个方面：①首先需考虑样品在溶剂中溶解度。②溶剂一般需无水溶剂，而且不与水互溶。③溶剂的沸点要适宜，一般讲溶剂沸点以40～80℃为宜。④溶剂纯度要高

7、，溶剂中即使是微量杂质的存在，有时也可明显地改变吸附性质。⑤当一种溶剂对某一物质吸附作用过强时，则洗脱困难，过弱时不能产生满意的色谱图，这种情况下可采用按一定比例制备多元混合溶剂系统，以调整洗脱能力。一些常用溶剂的洗脱能力见表6-2。色层分析法表6-2　一些常用溶剂的洗脱能力色层分析法二、分配柱层析分配柱层析是利用各组分在两种不相混溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离，它相当于一种连续性的溶剂抽提法。1．分配系数K一定量的溶质在两种不相溶的溶剂中达到平衡时，溶质在两种溶剂中的浓度比值为一常数，此常数称为分配系数。色层分析法2．分配柱层析原理为便利研究

8、，假设分配柱是由两迭并列的小方盒组成，见图6-3，其中S行代表固定相，M行代表流动相，两相互不混溶。假设溶质在各盒之间能左