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1、XX大学毕业论文MMP2、MMP9和VEGF在肾癌中的表达与临床意义姓名：2014年6月25日MMP2、MMP9和VEGF在肾癌中的表达与临床意义作者：卜宏民王连渠闫拥军焦志灵徐国良【摘要】目的探讨基质金属蛋白酶2、9（MMP2、MMP9）与血管内皮生长因子（VEGF）在肾癌组织屮的表达与临床分期的意义。方法蛋白免疫卬迹法、ELISA和逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）检测癌组织MMP2、MMP9,蛋白质免疫印迹法和RTPCR检测癌组织VEGF。结果肾癌组织屮MMP2、MMP9和VEGF明显表达，随着病程的进展M
2、MP2、MMP9和VEGF活性逐渐增高，以IV期晩期最明显，VEGF与MMP2、MMP9表达具有正相关性。结论MMP2、MMP9和VEGF参与了肾癌临床病情进展和发病机制。【关键词】肾癌；基质金属蛋口酶；血管内皮生长因了基质金属蛋白®（MMP2和MMP9）及其组织抑制物因子（TIMPs）在恶性肿瘤浸润转移中的作用已成为研究热点（1，2）,其中能够水解基底膜主要成分IV型胶原的MMP2（明胶酶A）、MMP9（明胶酶B）由于参与了细胞外基质（ECM）的降解和血管的发生，被认为在恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要的作用（2）
3、。血管内皮生长因子（VEGF）是一种增加血管通透性并促进新血管生长的细胞因子,在许多恶性肿瘤呈高表达并与侵袭转移和预后等生物学行为关系密切，可能与肿瘤及肿瘤转移灶的生长中的血管生成有关（3,4）。但三者在肾肿瘤组织中表达及其关系的文献报道的述不多，本文检测了肾癌组织屮MMP2、MMP9和VEGF的表达，探讨其与肾癌临床分期的关系与意义。1资料与方法1」一般资料67例肾癌标本取自2004年1月〜2007年10月在本院外科手术切除的肾癌患者。其中男33例，女34例，年龄36〜82（平均54±18.5）岁。按国际抗癌联
4、盟（1987年），TNM分期：其中I期4例，II期27例，III期30例，IV期6例。全部患者均经手术及病理证实。所冇患者术前均未行放、化疗，手术标木取材后立即放人液氮罐保存。肾癌临床分期标准根据肾壁增厚程度及是否外侵、有无远处转移，可将肾癌分为4期，I期（即早期）：腔内肿块或局限性肾壁厚（3〜5mm）；II期：肾壁厚＞5mm,但未侵及纵隔，也无远处转移；III期:肾壁厚＞5mm,侵犯周围组织，也可以有纵隔淋巴结肿大，但无远处转移；IV期：肾壁厚＞5mm,不但侵犯周围组织，且冇远处转移。1.2方法1.2.1ELI
5、SAMMP2、MMP9和VEGF抗体和酶联免疫吸附法试剂盒购自福建迈新生物科技发展冇限公司。液氮罐保存肾癌组织按2.5ml/g质量加入相当体积的冰牛理盐水，用匀浆器将组织研磨，然后在冰浴下超声波粉碎制成匀浆,4°C,10000r/min离心10min,取上清液。实验严格按照MMP2、MMP9和VEGF酶联免疫吸附法说明书步骤进行。1.2.2Western印迹检测法用Western印迹方法检测肾癌组织MMP2＞MMP9、VEGF含量。按10ml/g的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用二嗪啾甲酸（BCA
6、）法进行蛋白定Bo10%的十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝脑电泳（SDSPAGE）法上样量为28pg。电泳条件:4°C。电流20〜30mA。电泳结束后，进行蛋口质转膜。转膜条件：采用孔径为0.22m的硝酸纤维索膜（NC）,4°C,电流400mA,转膜3h。Western印迹杂交步骤如下:10%脱脂牛奶封闭NC膜lh,TYBS（20mmol/LTrisHC1,pH7.5；0.15mmol/LNaCl；0.05%Tween20）漂洗3次，毎次10min,然后室温下与APP、MBP（1:1000）杂交反应3h,吐温20/Tr
7、is盐酸缓冲液（TTBS）漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:5000）杂交反应1ho最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10min,加入ECL试剂反应5min,保鲜膜包裹，暗室X光胶片曝光、显影和定影。然后同一张NC膜再与卩actin（1:1000）进行Western印迹杂交反应，并获得蛋口印迹结果。Western印迹条带经Geloc凝胶成像分析系统扫描处理，计算单位吸光度值和条带面积,将各实验点的总吸光度值与对照组比较,得到相对百分数。1.2.3逆转录聚合酶链反应法(RTPCR)提取各组
8、肾癌组织总RNA并定量，用DNA酶I处理总RNA以去除DNA污染,各实验组取同等量的RNA反转录后进行PCRoMMP2、MMP9和VEGFPCR引物设计见表1(北京奥科生物科技有限公司)。将PCR扩增的产物5
9、11在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳,电压一般为70〜80Vo电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用QuantityOne4.4.0软件行定量分析，以目的
