菌种扩大培养

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1、第三章菌种扩大培养第三节微生物菌种生长条件温度pH氧种龄接种量温度最低生长温度：微生物能进行繁殖的最低温度最适生长温度：微生物生长繁殖速度最快温度最高生长温度：微生物能进行繁殖的最高温度致死温度：致死微生物的最低温度pH大多数微生物生长适应的pH跨度为3-4个pH单位，最佳生长pH跨度在0.5-1pH最适范围:细菌和放线菌6.5-7.5；酵母和霉菌在4.5-5.5氧影响因素培养及成分和浓度菌龄影响发酵条件影响有毒代谢产物影响通风和搅拌培养罐深，搅拌转速大，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解度就大，培养基的黏度越小，氧

2、的溶解度越大过度搅拌会导致培养液大量涌泡，增加染菌机会种龄与接种量：种龄(seedage)指种子罐培养种子从开始至结束的培养时间。在种子罐中，培养时间延长－－菌体量增加－－基质消耗及代谢产物积累－－菌体量不再增加－－老化过老：生产能力下降，菌体自溶。过嫩：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至造成异常发酵。适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，培养１２小时接种，酶活最高。接种量(seedvolume)指移入的种子的体积和接种后

3、培养液的体积比。Antibiotic：7%~7.5%Glu：1%接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基质的利用２、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。e.g.嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶接种1%，酶活最高；1.5%~4%影响不大；大于4%，酶产量明显下降。第四节菌种扩大培养种子扩大培养：将保存在砂土

4、管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。菌种扩大培养的目的：发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会优良种子应具备的条件菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。种子制备

5、过程实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等）或液体摇瓶培养生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养种子制备步骤斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基或斜面（静置培养）培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽

6、慢的菌种，可以用液体培养法(通过摇瓶培养提供比较好的溶氧）。实验室种子的制备-1e.g产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种斜面试管获得孢子250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。对于不产孢子的赤霉素生产菌，也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌，产卡那霉素的卡那链霉菌，可以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子

7、。不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。e.g.Glutamicacid-producer：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种）固体试管斜面（32°C，18~24小时）三角瓶培养（摇床）(flaskculture)种子罐培养放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为

8、28˚C。培养时间为5~14天。碳氮源不要太丰富干燥和限制培养直接或间接诱导孢子形成母斜面孢子接种利于防止菌种变异；子斜面孢子接种利于节约菌种用量霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28˚C。培养时间一般为4~14天。细菌培养物的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限