rna提取策略及rt-pcr技术_2

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1、RNA提取策略及RT-PCR技术笫一部分RNA提取策略1、RNA降解的原因内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因为人体细胞自身就是儿十分钟（20min?）mRNA被降解一轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开英中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起来。外源性RNA酶也是一个需要注意的因素，最常见的就是毛发尤其头发，灰尘，唾液，赠料手套这四个兄弟。针对它们我们应该戴帽子，口罩，橡胶无菌手套，在清洁灰尘少的地方提取RNAo我上面说了内源性RNAase污染才是关键，所以有些同志没有注意这些对外源性RNAase的防护RNA也提取的很出

2、色。但是如果你运气不太好的话外源性RNAase污染影响很人的。2、样品的取材我们抽提RNA往往都是需要KmRNA,而mRNA的表达量和细胞或者组织的生长状态息息相关，我们取组织块应该避免取到坏死组织，而细胞我们应该在其处于生长旺盛的时期收集（贴壁细胞消化要迅速，离心要稍为快些，甚至可以不消化下來直接进入裂解步骤；此外述町以采取先震荡敲击培养瓶的方法使细胞和培养瓶的结合下降，然后用吸管吹打培养基地方法把细胞吹打下来，这样细胞的代谢不会明显的受到抑制。注意在平时传代的时候就要注意观察细胞除了用胰酶消化下來以外是否还有其他比较简单的方法）（此外还可以把培养液倒掉后迅

3、速的加入裂解试剂开始抽提RNA）。3、待提収样品保存方法这些保存方法温度从4度到零下196度不等，选择哪一种保存方法关键是要对这些保存方法的优缺点有清醍的认识。根据你•需要的RNA种类可以做简单的分类o包括•RNA病毒RNA,mRNA（各种）,rRNA等其屮最容易降解或者破坏的就是mRNA,最不容易损失的就是RNA病毒RNA（因为有蛋口売保护）。超低温保存：特指液氮保存不管组织还是细胞如果需耍其中的mRNA必须在液氮中保存，・70度等方法都是错误的方法,在很短的时间内或许可以，但是长期是不可能的。・20〜〜〜.70摄氏度保存：RNA病毒的RNA可以在这个温度段

4、安全的保存。但是其产牛的mRNA还是必须超低温保存。4度保存：有特殊的保护试剂存在地悄况下纟R织的保存：应该是离体示在lmin内就放入液氮或者保护试剂小。由于提取RNA对组织块有一定量的要求，大约100陀居多（脂肪细胞需耍的量多的多，因为细胞是大大膨RNA可以分为总RNA,mRNA,VimsRNA（RNA病毒）几类Trizol即界硫亂酸11心苯酚法，这种方法的原理是：首先川强变性剂界硫亂酸恥裂解细胞，同时使核蛋白复合体屮的蛋口变性，释放出核酸。释放出來的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开来。进

5、一步通过冇机溶剂来抽提沉淀RNA,就可以得到纯净的RNA；Trizol最早是MRC实验室的科学家发明的方法，后來把专利卖给了invitrogen/Gibco,invitrogen/Gibco将此方法推广到世界。他的trizol曾经由其他公司OEM制作，现在己经口己生产。木来Trizol是一个专利的品牌，但是国内也有不少仿制的品牌，基木的原理是一样,配方稍有不同。RNeasykit：Qiagen的王牌产品，号称适用于各种RNA抽提，其实在特殊的组织比如大脑，肌肉，脂肪组织还是选择特殊抽提试剂为佳。此外细菌RNA抽提也最好使川专川抽捉试剂盒。这些产品Qiagen都

6、提供。注意凡是Qiagen的试剂盒抽提应该是没冇5S带的，因为它将5S破坏掉了。具他的比如roche,promega等都很好的是的。尤具promega性价比最高！注意各种方法对于组织都盂要先碾磨，应该用陶瓷碾磨器，同时一定要在碾磨同时不断的加入液氮。（少数牛人号称从来不加液氮也提取的很好，我只能说他运气实在不错）。特殊的RNA抽提试剂盒—mRNA抽提试剂盒：单纯的抽提mRNA的试剂盒很少见到有人在使用，但是其具有一般RNA抽提试剂盒没有的优点，在一些实验中有出奇致胜的效果,推荐promega的总RNA提取KIT,效果-kiQiagen差不多，价格便宜多了，性价

7、比最高的好东东！试剂盒提取的英优点有以下儿点：1、捉取得mRNA纯度高，因为对于很多实验rRNA其实也是一种污染，我们只想RT我们需要的mRNA,但是如呆用特界性引物或者随机引物就会连rRNA-•起RT,造成人量的我们不需要的cDNA出现。2、鉴定时观察是否有严重的DNA污染吋非常方便。inRNA抽提后电泳只是看到淡淡的一条短拖影带，此时如果有DNA污染可以很容易发现，因为背景很浅。3、RNA的鉴定RNA抽提出來之后，首先做的工作是分装保存，然后取具中一管丿IJ于鉴定。鉴定方法如下：对RNA的鉴定包括儿个方而，第一是数量的鉴定，第二是质量的鉴定，重点是质量的鉴

8、定。-般的琼脂糖凝胶电泳，注意不要用甲