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1、实验四十二从牛奶中分离鉴定酪蛋白和乳糖一、实验目的1.了解从牛奶中分离鉴定酪蛋口和乳糖2.掌握旋光仪和薄层色谱分析的实验方法二、基本原理酪蛋口是牛奶屮主要蛋口质，其浓度约为35g/L,是含磷蛋口质的复朵混合物。蛋口质是两性化合物，溶液的酸碱性直接影响蛋白质分子所带的电荷。当调节牛奶的pH值达到酪蛋口的等电点（pl）4.8左右时，蛋口质所带止、负电荷相等，呈电中性，此时酪蛋口的溶解度最小，将会以沉淀的形式从牛奶中析出。而乳糖仍存在于牛奶中，通过离心的方法能将酪蛋白和乳糖分离出。根据酪蛋白不溶于乙醇
2、和乙瞇的特性，可用乙醇洗涤以除去粗制品屮的脂质,使酪蛋白初步得到纯化。牛奶中含有40%-60%的乳糖，乳糖是一种二糖，它由一分子半乳糖及一分子葡萄糖通过弘1,4背键连接。在乳糖分子中，仍保留着葡•萄糖部分的半缩醛轻基，所以乳糖是还原性二糖,它的水溶液有变旋光现象，达到平衡时的比旋光度是+53.5。含有一分子结晶水的乳糖的熔点210°C。三、主要药品与仪器冰醋酸，乙醇n=0.95,乙瞇，牛奶，浓盐酸，pH试纸Ph=3-5,PH=7-9,硅胶G,0。02mol/L醋酸钠溶液，乙酸乙酯，异丙酸，毗噪，
3、苯胺，二苯胺，牛乳糖（纯），葡萄糖（纯），活性炭粉，浓硝酸，米伦试剂，硫酸，100g/L氢氧化钠溶液，50g/LM氧化钠溶液，10g/L硫酸铜溶液，滤纸，尼龙布（200目）o低速冷冻离心机（大容量），口动指示旋光测定仪，层析缸，抽气吸滤瓶500mL,布氏漏斗，农面皿，烧杯600mL,400mL,100mL,圆底烧瓶，冷凝管，试管lOXIOmm,薄层层析装置，三角烧瓶5（）0mL,lOOmL,容量瓶25mL,恒温水浴。四、操纵步骤1.从牛奶中分离酪蛋白取50mL去脂牛奶置于150mL烧杯内⑴。在水
4、浴锅中小心加热至40°C,保持温度，边搅拌边慢慢滴加4mL冰醋酸，此时即有白色的酪蛋白沉淀析出，继续滴加稀醋酸溶液，直至酪蛋白不再析出为止，混介液的PH值为4.8l2Jo继续搅拌并使悬浊液冷却到室温。放置lOinin后，将混合物放入离心杯屮，于3000r/niin离心15min。经滤布过滤上清液于100mL烧杯中，保留做乳糖的分离试验。沉淀（即酪蛋白）转移至另一个烧杯中，加15mL体积分数为二0.95的乙醇，搅匀后于布氏漏斗中抽气过滤，过滤后用滤布代替滤纸。用体积比为1：1的乙醇■乙讎混合液小心
5、洗涤沉淀2次（每次l（）mL）,最后再用5mL乙讎溶液洗涤1次⑶,然后吸滤至干。将干粉铺于表面皿上在室温下挥发去乙醴，烘干，称量并计算牛奶中酪蛋白的含量。取少屋酪蛋白溶解于水中，用缩二腺反应，蛋白黄色反应，米伦反应分别定性地观察产生的蛋片质呈现色。2.乳糖的分离和鉴定将实验1屮离心分去酪蛋白后的上清液（即乳清）置于小蒸发皿屮，用蒸气浴小心浓缩至5mL左右，稍冷却后，迅速加入10mL95%乙醉，并用玻璃棒搅拌摩擦，使乳糖析出完全。经布氏漏斗抽气过滤用95%乙醇将乳糖品体洗涤2次（每次用95%的乙醇
6、将乳糖晶体洗涤2次每次5mL）,即得粗乳糖晶体。将得到的粗乳糖晶休溶于尽可能少的热水中（50-60°C,约8-lOmL）0然后再在次热溶液中缓慢滴加乙醇，边加边摇，直至产生混浊为止，再小心水浴中加热使混浊消失，将泯合液放置过夜，让其自然冷却，吸滤收集析出的晶体用95%乙醇将乳糖晶体洗涤两次（每次用95%乙醇将乳糖品体洗涤2次每次5mL）。抽干，产品即含冇一分子结品水的纯乳糖（C12H22O1LH2O）。将精制后的乳糖干燥并测定其比旋度。1.乳糖的变旋光现彖⑷精确称取1.25g乳糖于一小烧杯中，加
7、入少量蒸馅水使乳糖溶解，迅速转入25mL的容量瓶中，用蒸係水将溶液稀释至刻度，混匀。小心将溶液装于旋光管中，立即测定其旋光度。每隔一分钟测定1次，直至8min完成，记录数据。lOmin后，每隔2min测定1次旋光度,继续至20min°记录数据并计算出比旋光度。迅速在样品管中加入2滴浓氨水⑸摇匀，静置20min后测其旋光度并计算出比旋光度。2.乳糖的水解及水解物的TLC鉴定1）乳糖的水解取lg自制的乳糖溶于8mL蒸馅水中，并在此溶液屮加入5滴浓硫酸，将此混介物在带有冷凝管的50mL磨口圆底烧瓶中加
8、热回流lh,回流结束后使反应液冷却，加少暈活性炭粉，再将此溶液煮沸5min。反应液冷却后，加入100g/L氢氧化钠溶液至溶液不再析出沉淀为止，将反应液小心加热片刻，使溶液中的硫酸完全转化为硫酸顿，抽气过滤，在滤液中加入5滴冰醋酸，并在40-50°C水浴浓缩成糖浆状。趁热将其溶于4mL冰醋酸中，使溶液变澄清,冷却，即有结晶析出。待结晶完全后,抽气过滤,先用2mL冰醋酸洗涤1次,再用2mL卬醇洗涤1次，最后用2mL95%6醇洗涤，吸干，将产品倒入表面川L内，干燥。2）糖类的硅胶G（GLC）鉴定用0.
