血管内皮生长因子（vegf）单克隆抗体的制备及鉴定

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1、血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体的制备及鉴定作者：石琦，单冰，高晨，姜慧英，张宝云，韩俊，董小平【摘要】目的：制备血管内皮生长因子Q間单克隆抗体（n^b）,并对其特性进行鉴定。方法：以重组HisTrxVKF1165蛋白为抗原，通过免疫、融合、克隆和筛选等方法制备VBSFinAb,制备小鼠腹水并测定其效价、染色体数目及免疫球蛋白亚类，用Asternblot方法分析其特异性。结果：成功筛选出能稳定分泌的杂交瘤细胞株4E4H5,制备腹水的ELIS磁价为1：106;染色体数目为105条；抗体分型为1心1亚型，％轻链；Asternblot证实所获得的啟可与VKF

2、全长蛋白发生特异性反应，但是与融合蛋白的标签蛋白HisTix不发生反应。结论：制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高滴度和高特异性的VB3FmAb,为建立能够用于肝癌诊断的血清VBGF检测技术提供了参考。【关键词】血管内皮生长因子单克隆抗体酶联免疫吸附试验血管内皮生长因子Vascularendothelialgrowthfactor,VKD最早是出Leunq等Cl］于1989年在牛垂体星状细胞培养液屮提纯的蛋白质。它是胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异的有丝分裂原，也是一种血管形成和血管通透性诱导因子，在血管发生和形成过程中起着重要的调控作用②。肿瘤

3、的生长和转移是一个多步骤的复杂过程，其中肿瘤血管的生成起重要的作用。迄今为止,VB2F被认为是肿瘤组织屮促血管生成的最主耍的血管生长因子氏。近年来，人们已经在人和动物的多种肿瘤组织，包括肝癌细胞屮都发现VB3F的过度表达，且表达水平随着癌变程度增加而逐渐升高。另外，VBT的表达与血管生成及细胞增生程度相关，且其过度表达影响肿瘤的侵袭和转移⑷。基于这些理原制备了小鼠抗人VB药全长蛋白的单克隆抗体（nAb）,并对其特性进行了鉴定,获得了能稳定分泌抗VB3FiiAb的杂交瘤细胞株。论基础，我们在原核系统中表达了含165个氨基酸的V涂长蛋白,以此为免疫1材料和方法1

4、.1材料HisTrxVB3F1165蛋白、pET32a载体、Sp"）小鼠骨髓瘤细胞株由本室制备保存；弗氏完全、不完全佐剂购自Si和a公司；次黄瞟吟氨基蝶吟胸腺唏喘核昔（HU）及次黄卩票吟胸腺唏喘核昔（HI）购自Hyc1one公司；PB31500购自Roche公司；antiVBlFirAb购自磁arrp;D公司；辣根过氧化物酶（两山羊抗小鼠勾自PIERCE公司；小鼠mAb分型检测试剂盒购自Roche公司；ECL检测试剂盒购自PerkinElmer公司；ELISA显色液购自北京万泰生物公司；纯系小鼠（48周龄，雌性，质量17〜20劝，购自近年来，人们已经在人和动

5、物的多种肿瘤组织，包括肝癌细胞屮都发现VB3F的过度表达，且表达水平随着癌变程度增加而逐渐升高。另外，VBT的表达与血管生成及细胞增生程度相关，且其过度表达影响肿瘤的侵袭和转移⑷。基于这些理原制备了小鼠抗人VB药全长蛋白的单克隆抗体（nAb）,并对其特性进行了鉴定,获得了能稳定分泌抗VB3FiiAb的杂交瘤细胞株。论基础，我们在原核系统中表达了含165个氨基酸的V涂长蛋白,以此为免疫1材料和方法1.1材料HisTrxVB3F1165蛋白、pET32a载体、Sp"）小鼠骨髓瘤细胞株由本室制备保存；弗氏完全、不完全佐剂购自Si和a公司；次黄瞟吟氨基蝶吟胸腺唏喘核

6、昔（HU）及次黄卩票吟胸腺唏喘核昔（HI）购自Hyc1one公司；PB31500购自Roche公司；antiVBlFirAb购自磁arrp;D公司；辣根过氧化物酶（两山羊抗小鼠勾自PIERCE公司；小鼠mAb分型检测试剂盒购自Roche公司；ECL检测试剂盒购自PerkinElmer公司；ELISA显色液购自北京万泰生物公司；纯系小鼠（48周龄，雌性，质量17〜20劝，购自北京生物制品研究所动物部。1.2方法1.2.1免疫动物将100卩够屯化的HisTrxVKF1165蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化，经腹腔注射免疫BA&t小鼠。以后每隔2周进行1次

7、免疫，采用100卩gHisTrxVffiFl165蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合、乳化后经腹腔注射免疫，共免疫4次。1.2.2杂交瘤细胞株的制备提前制备正常RXL肌小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞，进行细胞融合◎:末次免疫后3蹶脾，同时眼部取血，离心分离血清备用。将小鼠脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞按10：1比例混合于50mL尖底离心管屮，置于37C水浴屮，于lniin内缓慢滴入ImL预热的PB31500,静置5min,用无血清RM1640液终止作用，离心收集细胞。将细胞首先悬于含HOT的选择培养基中，接种于96孔培养板中，100卩W,接种密度为每孔1

8、个或2个细胞，10d后改用HT培养液，3周后改用普通