质粒DNA提取纯化与验证

质粒DNA提取纯化与验证

ID:46855762

大小:198.00 KB

页数:10页

时间:2019-11-28

质粒DNA提取纯化与验证_第1页
质粒DNA提取纯化与验证_第2页
质粒DNA提取纯化与验证_第3页
质粒DNA提取纯化与验证_第4页
质粒DNA提取纯化与验证_第5页
资源描述:

《质粒DNA提取纯化与验证》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库

1、......【实验目的】1、掌握碱变性提取质粒DNA法的原理、过程及各种试剂的作用。2、掌握凝胶电泳对DNA分离纯化的原理和方法。【实验原理】1、提取、纯化质粒DNA(碱变性提取法)提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中,碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单,易于操作,一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:培养细

2、菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,

3、而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通过酚/氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。2、琼脂糖凝胶电泳电泳(electrophoresis)是带电学习好帮手......物质在电场中向着与其电荷相反的电极

4、方向移动的现象。各种生物大分子在一定条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质,它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段,是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速,分辨率高,分辨范围极广。此外,凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBRGold染色直接观察到,甚至含量少至

5、20Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话,这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收,用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中,常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径,也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖凝胶电泳易于操作,适用于核酸电泳,测定DNA的相对分子质量,分离经限制酶水解的DNA片段,进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中,由于核酸有磷酸基而带负电荷,在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素:1)样品D

6、NA分子的大小:电泳时,线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的,其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比,这是因为大分子有更大的摩擦阻力。2)DNA分子的构象:相对分子质量相同而构象不同的DNA分子,其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中,由于各种因素的影响,使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)的一条链断裂,变成开环DNA(opencircleDNA,oeDNA)分子,如果两条链发生断裂,就转变为线状DNA(1inerDNA,LDNA)分

7、子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下,超螺旋型迁移速度最快,其次为线状分子,最慢的是开环状分子。3)琼脂糖浓度:琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径,一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低,则凝胶孔径越大,DNA电泳迁移速度越快,因此,相对分子质量越大,选用的凝胶浓度应越低。4)电泳所用电场:低电压条件下,线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比,电压越高,带电颗粒泳动越快,但随着电场强度的增加,不同长度DNA泳动的增加程度不同,因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为

8、了获得DNA片段的最佳分离效果,电场强度应小于5V/cm。学习好帮手......5)缓冲液:缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水(如不慎误用去离子水配制凝胶),溶液的导电性很少,带电颗粒泳动很慢,DNA几乎不移动;而在高离子强度下(如错用10×电泳缓冲液),导电性极高,带电颗粒泳动很

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。