【医学遗传学实验指导】医学遗传学综合实验

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1、第五章医学遗传学综合实验一、实验目的1.掌握利用系谱与DNA检测所得到的信息和结合用于产前基因诊断的方法；2.了解DNA分析技术在遗传病产前基因诊断中的应。二、实验原理（―）PCR-RFLP分析技术PCR-RFLP分析技术是在PCR技术基础上，根据限制性内切酶识别位点改变而导致的酶切位点增加或消失的特点，对DNA进行鉴定;利用PCR特异扩增的DNA片断中包含某个碱基突变，经特定限制酶切割后，通过凝胶电泳分离酶切产物大小，比较分析与对照样本的异同，判断该DNA是否存在突变。应用PCR-RFLP分析技术可以检测已知的点突变，也可以在家系中连锁分析进行基因诊断。（二）FVHI基因FVI1I基因位于

2、人类染色体Xq28,长186kb,由26个外显子及25个内含了组成。根据FVH1基因序列，木实验利用PCR结合RFLP设计了一对特异性引物，首先扩增出FVn基因长度为142bp的特异性片段,然后选择BelI限制性核酸内切酶对扩增产物进行消化，野生型棊因拥有限制性核酸内切酶BelI的酶切位点，可被切为99bp和43bp两个片段；而突变型基因没有限制性核酸内切酶Be/I的酶切位点，不会被BelI切断，酶解后仍为142bp的片段；如果酶解后142bp、99bp和43bp片段均出现，说明是野生型基因与突变型基因的杂合子（图5-1,图5-2）oIPCR'有BelI切割位点

3、BclI酶切clI切割位点I

4、BelI酶切［电泳99bp43bp］电泳142bp图5-1PCR-RFLP分析FW1基因原理图图5-2PCR-RFLP分析F训基因结果示意（三）血友病A病例姓名：李XX性别：男出生日期:1979年5月民族：汉现住址：XXXXXX就诊口期：2000年7月（XX医科大学XX临床学院血液室）主诉：反复岀血不止、关节肿痛15年，加重1年现病史：15年前，于轻微外伤后出血不止，外用凝血药止血后未予治疗。此后齿龈、舌、口腔、鼻经常出血，而膝、踝、肘等部位常于轻微外伤后出现淤斑、关节肿痛，症状逐年加重。查体：神志清楚，语言流利，贫血貌，膝、踝、肘关节僵硬变形,肌肉萎缩。实验室检查：①凝血时间延长；②凝血活

5、酶时间显著延长；③血浆中抗血友病球蛋口减少；④出血时间、凝血酶源时间、纤维蛋口原含量、毛细血管脆性及血小板数均止常。【注：血浆因子VID活性的正常均值定为100%（范围50%〜200%）。甲型血友病血浆因子VIII活性水平低于5%,重型＜2%。】家族史：家系中两个舅舅曾患类似病死亡，现有一同胞弟弟患有同病，同胞现年7岁，已出现岀血时间延长，出血不止症状。三、实验准备（材料、试剂、仪器）（一）试剂1・模板DNA（50ng/u1）＞引物I和II（20uM）、TaqDNA聚合酶（5u/ul）、10XPCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）＞灭菌蒸锚水、矿物油、限制性内切酶BelI（20U/U1）.

6、10X酶切缓冲液。2.30%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29：1）、5XTBE、2%过硫酸鞍、TEMED、6X±样缓冲液、DNA分子量标记、5mg/ml澳化乙锭（EB）染液、无水乙醇（三）仪器和设备PCR自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器、枪头及离心管、容器盒、恒温水浴箱、制胶玻璃板、制胶架、聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、5ml注射器、12号针头、25U1玻璃注射器、烧杯、脱脂棉、保鲜膜、染色盒、微波炉、250mlH角烧瓶、透明胶带、称药盘、天平。四、实验方法与步骤（―）PCR反应PCR反应体系20卩1,其成分如下：模板DNA2u110XPCR缓冲液2u1TaqDNA聚合酶0.2u12.5mMdNTP

7、1P120uMPrimerI0.5u120uMPrimerII0.5u1ddH2O13.8u1总体积20u1PCR反应循环温度：95°C变性2min,94°C40s；55°C30;72°C50°C,共30个循环，最后经72°C延伸5min,反应结束后置4°C冰箱保存（二）PCR产物的Bc/I酶切反应体系30u1其成分如下：PCR扩增产物12u10X酶解缓冲液3u1BelI限制酶1u1ddH2O14u总体积30u1置50°C水浴消化2小时，4°C保存。（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳1・制备12%聚丙烯酰胺凝胶5mlo力0TEMED5u1和0・4ml过硫酸钱，混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全凝聚后，

8、拔出加样梳子,安装电泳装置，加入电泳缓冲液（1XTBE）,缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲洗加样孔，预电泳20分钟。2.每份限制酶切产物取10ul,加2ul的6X载样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以100V电泳50分钟。3.拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，切去左上角，作好标记后放到一个朔料盘内，加EB染液染色3分钟。4・EB染色以后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察PCR-RFLP结果。五、注意事项