鼻咽癌细胞来源外泌体的提取和鉴定_黄雪琴

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1、广东医学2016年1月第37卷第2期GuangdongMedicalJournalJan．2016，Vol．37，No．2·191·*鼻咽癌细胞来源外泌体的提取和鉴定12111△黄雪琴，崔仲宜，蒋东辉，张月飞，罗国庆12广东医学院附属医院耳鼻咽喉科(广东湛江524001);广东医学院生物化学与分子生物学研究所(广东湛江524023)【摘要】目的从鼻咽癌细胞系CNE－1、CNE－2及SUNE－1中分离外泌体，并对CNE－2所得外泌体进行鉴定。方法使用ExoQuick－TC(SBI)试剂盒法从鼻咽癌细胞系CNE－1、CNE－2及SUNE－1培养上清液分离

2、出外泌体，使用透射电镜观察其形态特征，BCA法进行蛋白定量，Westernblot进行外泌体特异性抗原分子CD63及筏蛋白－1鉴定。结果3种鼻咽癌细胞系培养上清液中均分离出大量泡状物，透射电镜下观察呈圆形的囊泡，直径为40～130nm，具有完整胞膜。且CNE－2来源的此种泡状物表达外泌体特异性膜筏蛋白－1、CD63。10mL对数生长期CNE－2培养上清液得到487μg/mL(以蛋白计)的外泌体200μL。结论本实验室保存的3种鼻咽癌细胞系很可能均能产生外泌体，ExoQuick－TC(SBI)法能够简便快速地从鼻咽癌细胞系中提取到外泌体，不需要超速离心

3、，为鼻咽癌的防治研究提供了新的研究方法和靶点。【关键词】鼻咽癌细胞;外泌体;分离;鉴定DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.20160131.013鼻咽癌是位于头颈部的上皮细胞源性恶性肿瘤，Ｒad)。GIS凝胶图像分析系统(美国Bio－Ｒad)、Bio－恶性程度高，诊疗困难，病死率高，严重危害人类健康。ＲadiMark酶标仪(美国Bio－Ｒad)、HitachiCＲ22GⅢ鼻咽癌好发于非洲北部、东南亚以及中国南方各省，尤高速冷冻离心机(日本日立)、JEOL/JEM－1400透射其是广东省。放疗或放化疗联合是早期鼻咽癌的主要电镜(日本电子)

4、、Eppendorf5417Ｒ台式冷冻离心机治疗方案。放疗及综合化疗策略的改进改善了初期鼻(德国艾本德)、细胞培养箱(美国Shellab)。［1］咽癌患者的预后。但是，15%～58%的鼻咽癌患者1．2方法［2］会复发并遭受二次治疗。因而，鼻咽癌的复发成为1．2．1细胞培养液氮罐内取出冻存的细胞，42℃水临床医生最为棘手的问题。传统的治疗只能有限地局中快速轻摇解冻。含10%胎牛血清和1%双抗(青霉部控制及部分改善生活质量，更重要的是这些疗法通素－链霉素溶液，碧云天，海门)的ＲPMI1640细胞完常会诱导严重的晚期并发症，采取综合治疗就显得尤全培养液重悬

5、，1000r/min离心5mim，弃上清液，新2为必要。免疫治疗作为有效的新型疗法之一，其关键鲜完全培养基重悬后接种到60cm的培养皿中，置是寻找肿瘤特异性抗原。外泌体(exosome)由John-5%CO、饱和湿度的37℃细胞培养箱中培养。细胞生2［3］stone等首次从网织红细胞研究中发现和命名。随长至培养皿底板面积的95%左右，弃培养液，PBS清洗2［4－6］后更多学者证实多种细胞均可分泌外泌体，对其次，胰酶消化液消化，等体积完全培养液终止消化，1000产生、组成及功能的研究逐步深入。2014年8月至r/min离心5min，弃上清液，新鲜完全培

6、养基重悬细胞，2015年7月，本研究从鼻咽癌细胞系培养上清液中提1∶3比例进行传代，均使用60cm2培养皿，培养至对数生取外泌体，为研究鼻咽癌的发病、转移机制及免疫治疗长期，确定细胞生长状态最佳，准备用于外泌体提取。提供新的切入点。1．2．2收集条件培养基上述传代生长的细胞，长至1材料与方法培养皿底板面积的60%左右，弃培养液，PBS洗3次，1．1材料与设备鼻咽癌细胞系高分化株CNE－1、加入新的不含血清的ＲPMI1640细胞培养液，培养24低分化株CNE－2及EB病毒基因携带株SUNE－1(本h后收集条件培养基10mL，离心弃沉淀后，使用0.22实

7、验室冻存)、ＲPMI1640细胞培养液(美国GIBCO)、μm微孔滤膜(美国Millipore)过滤2次，4℃保存1周，胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶(海门碧云天)、－20℃长期保存。BCA法蛋白测定试剂盒(海门碧云天)、ExoQuick－TC1．2．3外泌体的提取细胞条件培养液10mL，4℃外泌体提取试剂盒(美国SBI)、兔抗－CD63(美国Ab-3000g离心15min去除细胞及细胞碎片;将上清液转cam)、兔抗－筏蛋白－1(Flotillin－1)(美国Abcam)、移至无菌管中，加入2mL的ExoQuick－TC沉淀液，反羊抗兔二抗(美国A

8、bcam)、ECL发光液(美国Bio－复颠倒3次使其混匀;冷藏(4℃)过夜(12h);10000g离心Exo