生物高中必修2第六章第二节

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1、11重组DNA技术11.1重组DNA技术是基因工程的核心技术11.2获得需要的目的基因（外源基因）11.3构建重组质粒和基因克隆11.4转化受体细胞和转化子的筛选11.5转化子的分析——Southern杂交重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技术，克隆(clone)---无性繁殖分子克隆–DNA的无性繁殖技术重组DNA技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。11.1重组DNA技术是基因工程的核心技术基因工程(geneticengineering)所谓基因工程(geneticengineering)就是把

2、外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物。重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成

3、互补的DNA片段，建立cDNA文库；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。（4）化学合成11.2获得需要的目的基因（外源基因）细胞内总DNA的提取分离与基因组文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序苯酚沉淀蛋白质紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解，经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。cDNA文库的构建mRNA反转录cDNA(互补DNA）第二条DNA链反转录人工合成互补DNA,cDNA构建

4、基因文库获取目的基因存在的问题——费时费事内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势——获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配

5、对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段PCR(多聚酶链式反应)PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授开汽车时的联想逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋行驶的汽车——一小段DNA引物……1988年发明了PCR技术1993年获得诺贝尔奖基因重组和克隆操作最重要的工具是：1.限制性内切酶2.载体和3.宿主菌微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。11.3构建重组质粒DNA和基因克隆限制性内

6、切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。分子刀-DNA限制性内切酶识别特定的核苷酸序列4~6个碱基对形成粘性末端或平端重组DNA的操作限制性内切酶已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶基因体外重组TheformationofarecombinantDNAmolecule载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制（2）具有合

7、适的限制性酶切位点（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小（6）细胞内稳定性高目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。质粒质粒载体的一般结构DNA克隆常用载体基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿