细胞活性测定方法介绍和使用探讨

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1、1.细胞活性测定方法介绍和使用探讨细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：1、MTT法MTT：化学名：3-(

2、4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲

3、产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。2、XTT法XTT：化学名：2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲产物的吸光度与活细胞的数量成正比。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；

4、2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。3、CCK-8法或称WST-8法CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲产物（Formazan）。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定

5、其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。缺点:1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。2.细胞复苏方法1．从液氮罐中取出安剖；有时因

6、安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。3．剪开纱布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。4．低速离心（500～1000转/分）5分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心。5．加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。3.细胞冻存方法4.常规组织培养法1）初代消化培养法1.准备：取各

7、种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组

8、织块的大小和组织的硬度而定。6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适