临床分子生物学检验总

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1、临床分子生物学检验总四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA）为主基因组DNA是临床分子生物学检验屮最常用的分子靶标病原牛物基因1•菌种鉴定：PCR■测序和PCR-DNA探针杂交;缩短检测时间2.确定病毒感染和病毒载量：明确感染源，判断病情，监测疗效3.病毒分析：基因型变异产生不同临床症状4.细菌耐药监测和分子流行病学调查:随机扩增多态性D

2、NA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1・致病基因的分子缺陷2•线粒体基因突3.肿瘤相关基因单基因病1•致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变,如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。2•致病基因中核背酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。基因多态性用于：1•基因定位和疾病相关性分析2•疾病诊断和遗传咨询3•多基因病的研究4•器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测(包括游离DNA和游离RNA)用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、

3、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。重要国际生物信息中心：1•美国国立生物技术信息中心(NCBD2.欧洲生物信息学研究所(EBI)3.日本国立遗传研究所(DDBJ)一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库冇SWISS・PROT、PIR、UNIPROT等。蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等。蛋白质数据库常用的有SWISS・PROT、

4、PIR、PDB数据库。二级数据库非常多，如人类基因组图谱库GDB、转录因子和结合位点库TRANSFAC、蛋白质结构家族库SCOP等。**乙型肝炎病毒核酸的检测常用技术J•普通PCR技术2•荧光定量PCR技术3.支链DNA技术4.核酸杂交技术5•杂交捕获系统6•基因芯片技术**HBV基因分型的方法：1,PCR-RFLP2.PCR-RBD3.ELISA4.基因芯人乳头瘤病毒基因组结构:HPVDNA为一双链闭环分子，基因组可分三个区段：早期区（E）、晩期区（L）、长控制区或上游调节区或非编码区。***HPVDNA检测及基因分型：核酸杂交技术（主耍包括核

5、酸印迹、原位杂交、杂交捕获等技术。目前常采用HCII技术、核酸分子杂交与PCR相结合的方法。具有较强的特异性，并可分型）2.PCR技术**（采用型特异性引物进行HPV快速分型，现已成为HPV感染最常用的检测方法之_。冃前常用通用引物-PCR（GP-PCR）和实时定量PCR。1.GP-PCR,依据不同HPV亚型有共同保守序列的特点来设计通用引物，可广谱扩增HPVDNA,具有较高的敏感性，可检测出10・400拷贝的HPV病毒含量。在GP-PCR的基础上，建立了巢式PCR和巢式多重PCR检测HPVDNAo提高了检测敏感性和多重感染率。2.实［I寸定量P

6、CR法，该法可实现HPVDNA定量和快速检测。现在市售产品可以检测E6和E7的mRNA；进行HPV16、18、31、33与45分型。检测灵敏度高，但设备昂贵，操作繁琐，不适于宫颈癌的人规模筛查。）3.基因芯片技术（基因芯片可对HPV进行分型和多重感染诊断，适于高通量HPV筛查）4•流式荧光液芯技术5飞行时间质谱技术临床意义：（-）宫颈疾病风险预测（二）疗效评估及术后跟踪（三）预防控制和疫苗研发**HIV-1基因组中,gag、pol、env为结构基因，编码病毒核心蛋白(gag)、多聚酶(pol)、和外膜蛋白(env)ovpr>rev>vif、tat

7、>vpu/vpx、nef等6个基因为调控基因，编码调控蛋口和辅助蛋口。核酸序列依赖扩增(NASBA)是一种等温扩增RNA的技术，能直接扩增单链RNA特异序列，通过合成cDNA,在等温条件下进行体外序列特异性核酸扩增。NASBA需要AMV逆转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7RNA聚合酶共同作用完成。NASBA分非循环相(模板RNA与引物I互补)和循环相(转录的反义RNA与引物II互补)两个阶段流行性感冒病毒核酸检测：主要有RT・PCR、实时荧光定量RT・PCR、基因芯片、逆转录■环介导等温扩增(RT・LAMP)等。结核分枝杆菌核酸的检测：l.PCR2

8、.Real-timePCR3.PCR-RFLP4.线性探针杂交法(LPA)5.链替代扩增技术(SDA)6•扩增结核分枝杆菌直接试验(AM