工业淀粉酶的纯化与分析试验报告

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1、word格式工业淀粉酶的纯化与分析一．实验目的1．掌握盐析法纯化分离蛋白质的工作原理和方法2．掌握利用葡萄糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的技术3．掌握测定淀粉酶活力的基本原理和方法4．学习Folin-酚比色法测定蛋白质含量的原理和方法二．实验原理工业淀粉酶含有大量杂质将其溶解浸提后离心，利用高浓度的硫酸铵溶液将上清液的蛋白质沉降下来，所得沉淀溶解后即为盐析液。利用葡糖糖凝胶G-25对大分子量蛋白质和小分子盐类的阻滞作用不同，从而经凝胶层析使盐析液中的蛋白质和盐类分离。酶活力是以酶在最适条件下，催化一定化

2、学反应的初速度来表示的。在本实验中，是以一定量的淀粉酶在37摄氏度，PH=6.8的条件下，每分钟水解淀粉酶生成1mg还原糖的量为一个酶活力单位，其中还原糖的量用DNS法测定。蛋白质在Folin-酚试剂的作用下生成钨蓝和钼蓝，测定其在500nm波长下的吸光度，从而求得样品中蛋白质的含量。三．实验材料及仪器设备1．材料：工业淀粉酶2．仪器：电子天平；离心机；UV9100型分光光度计恒温水域；沸水浴3．器材：刻度试管：25ml*21；移液管：1ml*6、5ml*1；烧杯：250ml*2、50ml*1;研钵

3、：一套；移液枪：一套；离心管：100ml*1;1.5ml*4;7ml*1;注射器：1ml*1；层析装置：1套；量筒：100ml*1；洗耳球：2个；胶头滴管：2个；移液管架；玻璃棒四．实验试剂BaCl2溶液（1%）考马斯亮蓝G-2501%NaCl溶液淀粉溶液（0.5%）磷酸缓冲液（0.2molr/L,pH6.8）NaOH溶液（2.5mol/L）牛血清蛋白（BSA）标准液（250ug/ml）Folin-酚试剂甲Folin-酚试剂乙葡萄糖标准液（1mg/ml）DNS试剂五．实验步骤1.浸提称取0.317g

4、淀粉酶制剂，经浸提离心后转移上清液1.2ml于离心管中，标记为“粗酶液”备用。记录剩余体积为18.2ml并转移到50ml烧杯里，置于冰浴中。2．盐析....word格式按70%的饱和浓度称取6.976g(NH4)2SO4固体，研细后，缓缓加入离心后的酶液中。待(NH4)2SO4固体溶解后，冰浴静置20min后离心，将离心后固体溶解于4ml蒸馏水中，并分装于3支1.5ml离心管中，标记“盐析”备用。3．脱盐用洗脱液洗脱柱子，经检验没有残留的盐和蛋白质后,对蛋白质进行脱盐。用注射器注射0.5ml盐析液，

5、上样完毕后，打开出水口，进行洗脱，并收集洗脱液，每管2ml。分别用BaCl2和考马斯亮蓝G-250试剂检验试管中洗脱液的成分。把含有蛋白质的收集液合并于离心管中，标记“脱盐”备用。4．酶活力测定粗酶液0.05ml加蒸馏水稀释至25ml，摇匀待用盐析液0.05ml加蒸馏水稀释至25ml，摇匀待用脱盐液0.2ml加蒸馏水稀释至10ml，摇匀待用空白标准葡萄糖浓度梯度粗酶液盐析液脱盐液012345A0A1B0B1C0C1葡糖糖液(ml)0.00.220.40.60.80.9　　　　　　淀粉酶液(ml)　　

6、　　　　0.10.10.10.10.10.1H2O(ml)3.23.02.82.62.42.3　　　　　　pH6.8缓冲液　　　　　　111111NaOH溶液(ml)　　　　　　111预热摇匀，37℃水浴，5min预热的淀粉酶　各1ml迅速摇匀酶促反应37℃水浴，5minNaOH溶液(ml)　　　　　　111DNS试剂各2ml迅速摇匀显色反应沸水浴5min，冷却定容至25ml，摇匀比色以0号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光度记录吸光度0.0000.0250.0980.1910.2760.28

7、0.1720.2950.1450.4930.2160.396还原糖（mg）0.0000.2000.4000.6000.8000.9000.50920.96330.7408....word格式5．蛋白质含量测定粗酶液0.5ml加蒸馏水稀释到10ml，摇匀；盐析液1.0ml加蒸馏水稀释到10ml，摇匀；脱盐液直接取用；样品处理：取样2g豆芽研磨水100ml定容，摇匀浸提10min过滤取14支试管按下表操作并记录实验数据。空白标准蛋白质浓度梯度样品1粗酶液盐析液脱盐液012345A1A2B1B2C1C2D

8、1D2BSA标准液(ml)0.00.20.40.60.80.9样品待测液(ml)11111111蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20.0Folin-酚试剂甲(ml)各5ml反应各管混匀，室温下放置10min各0.5ml....word格式Folin-酚试剂乙(ml)反应及时混匀，室温下放置30min比色以0号管为空白参比，测定λ=500nm处的吸光度记录吸光度(A500)0.0000.0480.0960.1190.1570.2040.1250.1170.17