遗传育种论文

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1、分子“剪刀”基因定点修饰技术TALENs论文摘要：转录激活子样效应因子核酸酶是最近新兴的又一种重要的基因工程工具，由TALE(transcriptionactivator-likeeffector)结构域和FokI核酸内切酶结构域人工融合而成，利用其造成的DNA的双链断裂可以介导各种高效率的遗传操作，包括基因修复、基因打靶、基因定点插入等。该技术的突出优势在于，相较于之前的方法，TALENs更容易实现在基因组上的定点修饰:TALENs中每一个重复片段(repeat)针对一个靶向基因的碱基，使得其设计与构建更为容易且高效；不存在对宿主基因组的外源基因插入；有很好的可操作性，对

2、物种没有选择性；并且可以在细胞和个体水平进行遗传操作。本文综述了TALEN技术的研究发展过程、结构与作用机制、构建TALEN的方法，以及目前这一技术的应用等。关键词：基因组定点修饰；基因工程：基因打靶1引言冃前，科技的发展使得越来越多不同物种的基因组完成测序得以实现，在此基础上研究物种中基因的功能也逐渐被科研工作者所重视。而在基因组上精确高效地进行定点基因修饰是进行基因组改造与研究基因功能的一个重要手段。比如在家畜屮使用定点基因改造可以优化异种器官移植以及生物制药产品，还可以用于产生人类疾病模型。然而，目前仅在小鼠和果蝇等少数模式生物中建立了较为成熟的基因敲除技术，此外的绝

3、大多数物种在这方面尚缺乏有效或成熟的技术手段，从而严重阻碍了这些物种中基因功能研究的深度。定点基因修饰主要是通过造成DNA的双链断裂再利用细胞自身的同源重组或非同源末端连接修复机制对基因组的特定位点进行各种遗传修饰。HR是通过外源基因与相应内源基因两侧的同源序列进行配对，造成两者位置互换，从而实现外源基因定点插入，缺失或者替换。而NHEJ是指在不依赖同源性的情况下，两个DNA片段在DSB区域进行强行连接的修复机制，可能会导致小片段缺失或者插入。ZFNs曾被认为是最有潜力的基因改造技术，它实现了基因的靶向操作，并得到了广泛的应用。利用ZFNs对HIV感染者T细胞中CCR5基因

4、进行敲除，并把改造后的细胞重新输入患者体内现在已经进入基因治疗的临床试验阶段。然而从商业公司获得高效的ZFNs需要支付高昂的费用，从锌指核酶委员会及Addgene±获得的ZF模块质粒，自行组装针对特定DNA序列的ZFNs,所需的工作量大，花费也十分昂贵，而且最终产生的ZFNs在细胞内会产生细胞毒性，因此有必要发展更为高效的基因定点修饰技术。最新发展起来的TALEN技术，具备ZFNs技术特异结合冃标DNA特异性的优点，同时消除了它的一些缺点。2TALEN技术的原理TALENs蛋白包括两个组成部分。第一个组成部分來自于天然TALE蛋白，其N端含有一个易位结构域；中间是一段由1.

5、5-33.5不等的TALE单元组成的重复氨基酸序列，每个单元又由34个氨基酸组成，其中32个氨基酸是高度保守的，只有第12位和13位氨基酸是可以变化的，能够特异地结合一个碱基序列，因此这两个氨基酸又被称为重复变异双残基，最后的0.5个单元只含有前面的20个氨基酸；天然TALE蛋白的C端含有一个核定位信号以及转录激活因子，能帮助TALE蛋白从细胞质进入细胞核同时发挥转录激活作用。研究发现，植物病毒合成的天然TALES蛋白中的C端和N端氨基酸的数目能够影响最终TALEN的活性，为了优化TALEN技术,Sun等采用酵母双杂交系统评价不同的N端和C端氨基酸数目及结合DNA序列数目组

6、合对TALENs活性的影响，结果发现N端和C端氨基酸残基都需要保持在一定数目时TALEN才能保持活性。TALENs的第二个组成部分为来自细菌的IIS型核酸内切酶Fokl,当两个Fokl发生二聚化后就会发挥活性对DNA双链进行切割，细胞DNA损伤后会启动两种修复机制过程，一种为末端非同源依赖的修复机制(NHEJ),另一种是依赖同源重组的修复机制(HDR)o当没有外源的同源序列加入吋，细胞就会启动NHEJ修复机制，将断开的DNA末端重新结合在一起，但是这种修攵机制是一种存在缺陷的修复过程，往往会引入新的突变，因此也就达到了进行基因敲除的目的。如果此时加入外源的同源碱基序列就可以

7、启动第二种修复机制HDR修复，利用同源修复机制，可以帮助我们实现基因敲进和基因修复，但是如果外源的同源序列是存在缺陷的，那么同样可以达到基因敲除的效果。3TALENs的结构优化及组装技术的建立经过对某些天然TALE的DNA靶点的分析，研究者发现，在识别位点的宁端是比较保守的碱基T,被认为是TALE识别靶向基因的一大关键。但是之后科研人员证明，当C■端域(C-terminalsegment,CTS)的长度较短，如31个氨基酸的情况下，5,端为T确实可以增强TALE的结合效率；但是在CTS的长度较长(63-117个氨基