口腔教学论文：口腔黏膜真菌鉴定方法的比较（_论文）

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1、口腔教学论文：口腔黏膜真菌鉴定方法的比较摘要：比较常见用于黏膜真菌菌种鉴别的多种方法，探寻最佳的鉴别方法。采集230例普通人群口腔黏膜样本，分别用玉米吐温培养观察厚膜抱子法、糖发酵生化反应法、CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法、ITS基因的PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)法、ITS测序菌种鉴立法，鉴别真菌各菌株。结果显示:有56例菌株至少通过1种方法检出真菌;玉米吐温分离培养假丝酵母菌37株；50例菌株ITS基因测序共鉴定出8个菌种，白假丝酵母菌(C.albicans)29株，近平滑假丝酵

2、母菌(C.parapsilosis)10株，热带假丝酵母菌(C.tropicalis)5株,Candidametapsilosisl株,Lodderomyceselongisporusl株，克柔假纟幺酵母菌(Candidakrusei)l株，乙醇假丝酵母菌(C.ethanolica)1株，季也蒙毕赤酵母菌(Pichiaguilliermondii)2株;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法鉴定出3种菌株，分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌；PCR-RFLP法检出5种菌株，分别是白假丝酵母菌、热带

3、假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、季也蒙毕赤酵母菌、克柔假丝酵母菌,与基因的测序鉴定一致率为91%；糖发酵生化反应法阳性标本占被检出真菌例数的46.4%(26/56)。结果表明：ITS基因的测序法可以准确鉴定真菌各个菌种;PCR-RFLP法能鉴定常见的菌种，但操作繁琐;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法能快速准确鉴别3种常见假丝酵母菌菌种;玉米吐温-80可以准确培养鉴别白假丝酵母菌;糖发酵生化反应法，缺乏足够的敏感度和特异性，难以准确鉴别各个菌种。关键词:真菌;内转录间隔区(ITS);CHROMagar显色培养基;

4、鉴定方法真菌在自然界屮广泛分布,既是人体正常菌群成员也是重要的条件致病菌,常在机体免疫力下降吋造成机会性感染。有资料显示，近年来临床分离的假丝酵母菌的感染率有增长趋势［1］,而在医院临床感染的致病菌中,白假丝酵母菌感染已跃居第4位［2］。明确感染菌种、正确鉴定与分类,对及时诊治、预防感染具有十分重要的意义。常规的病原学诊断主要通过观察真菌的外部形态特征及…些纶化特性来对其进行鉴定，近年来分子诊断技术逐渐应用于真菌种属的鉴別［3］。本实验运用多种不同的方法检测正常健康人口腔黏膜真菌带菌情况，分析各种方法的优缺点，探寻最

5、佳真菌菌种鉴别方法。1材料与方法1」材料1.1.1标本来源2008年1月至8月间230名辽宁中医药大学职业技术学院教职工和学生(所有研究对象均知情同意，口愿参加本项研究)。近3个月内未使用抗生素、糖皮质激素等免疫抑制剂，无肿瘤、糖尿病等导致免疫低下的系统性疾病。1.1.2标准菌株白假丝酵母菌ATCC1023k近平滑假丝酵母菌ATCC2019、热带假丝酵母菌ATCC750市温州康泰生物科技有限公司提供，作为各种鉴定方法的对照菌株。1.1.3主要试剂和仪器①试剂：CHROMagar假丝酵母菌显色培养基（郑州博赛生物技术股

6、份有限公司），糖发酵生化管（杭州天和微生物试剂有限公司），细胞溶解酶（Sigma,US）,蛋白酶K（Merk,Germany）,Tris>EDTASDS（Sigma,US）,三磷酸脱氧核糖核昔（Roche,Switzerland）,Taq酶（TaKaRa,大连宝生物工程有限公司），genefind-er核酸染料（Bio-V,厦门百维信生物科技有限公司）,DNA分子量标准为DL2000Marker（大连宝生物工程有限公司）,MspI酶（TaKaRa,大连宝生物工程有限公司），真菌ITS1-ITS4通用引物［4］（上海生

7、工生物工程技术服务有限公司）;②仪器:OlympusDP71图像采集系统（Tokyo,Japan）,ImageProPlus4.5software（MediaCyberneticsinc.,SilverSpring,MD,USA）DYY-8B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），蓝盾TM551可见光凝胶电泳■透射仪（Bio-V,厦门百维信生物科技有限公司），80-1离心机（上海手术器械厂）。1.2方法1.2.1真菌样本釆集用无菌牙签采集后牙邻间隙牙菌斑样本于Ep管中,・20°C保存。同时检查记录受检者年龄、性别、学历、

8、吸烟、饮酒习惯、口腔健康状况。1.2.2真菌分离培养牙菌斑样本加入200UL生理盐水吹打混匀，吸取20UL菌液接种于沙保罗琼脂平板,37°C培养24ho用无菌牙签收集菌落于Ep管中。1.2.3微量培养法在吴绍熙方法［5］基础上加以改进,在已高压灭菌的玻片上用微量加样器取10UL熔化的1%吐温・80玉米琼脂培养基,凝固后用接种针水平穿刺接种培养得