多酚氧化酶活性测定及控制文献综述

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1、文献综述多酚氧化酶活性测定及控制1前言多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。多酚氧化酶（PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。鲜切果蔬因组织被切分使PPO与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。抑制PPO活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、pH值和温度。一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜

2、等均已被用于防止果蔬酶褐变。本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬PPO活性的研究。2主题部分2.1从果蔬中提取PPO（以莲藕为例）2.1.1丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。适合需大量制样时使用）将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至．18。C的丙酮(w／v为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。称取丙酮粉O．5g，加入0．2mol／L，pH为5．4的预冷磷酸二氢钠．柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8000r／min离心10min，所得上层清液即为粗酶液。【1】2.1.2匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性）将

3、莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，抽滤。向滤渣中加入0．05mol／L，pH5．4磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(W／V为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8000r／min离心10rain，所得上清液即为粗酶液。【2】 2.2.3匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接用于研究）（1） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％

4、的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，4。C下静置4h，抽滤，所得滤液即为粗酶液。【3】（2） 每个处理准确称取莲藕20．0g，切碎后加入50．0mL磷酸缓冲溶液(pH6．5)冰浴研磨后，低温下离心5mill(3000r／rain)，取上清液得粗酶液。【4】（3）新鲜藕肉去皮打浆后，采用pH值为5．4的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液(含5％PVPP和10％NaCl)提取，料液比为l：2．2，置4℃冰箱中浸提4h，提取的莲藕PPO活性最大。【5】2.2PPO的分离纯化取10℃下贮藏到第8天的鲜切莲藕片组织250g，首先采用液氮速冻，按1：

5、2质量比例加入经过预冷(4℃)的0．1mol／L、pH6．8的磷酸缓冲液(内含5oA的PVP)，在高速组织捣碎机上捣碎，然后于4℃下浸提2h，用4层脱脂纱布过滤，滤液于10000r／min、4℃下离心15rain，上清液即为多酚氧化酶粗酶液。向粗酶液中边搅拌边加入固体硫酸铵至30％饱和度，4℃下静置2h，于10000r／rain、4℃下离心10min，弃沉淀，继续向上清液中加入硫酸铵至70％饱和度，4℃下静置过夜，然后于10000r／min、4℃下离心15min，弃上清液，将沉淀用尽量少的0．1mol／L、pH值为6．8的磷酸缓冲液溶解，

6、得到酶的提取液。然后将酶提取液用0．1mol／L、pH6．8的磷酸缓冲液透析过夜，中间换透析液2次，然后用amicon超滤杯浓缩至10mL。【6】2.3PPO活性的测定2.3.1消光值法测定PPO活性在lcm比色皿中，加入1．5mLpH7．0的磷酸盐缓冲溶液，再加入O．1mol／L邻苯二酚溶液1．0mL，迅速加入PPO粗酶液0．5mL，混匀。在420nm波长处测吸光度，每10s记录1次吸光度(0／)420)随时间的变化值。最后确定30s和lmin时检测，在室温下测定PPO的活性(27℃)，测定OD420值。以最初直线段的斜率(△OD／t，

7、卜时间，min)计算酶活力。一个相对酶活性单位定义为：该酶液在测定条件下每分钟引起吸光度值改变0．001所需的酶量。PPO相对活性=各处理组吸光度值／同组最佳处理组吸光度值×100％。【7】2.4抑制剂对PPO活性的控制2.4.1核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制将硫代硫酸钠(Na2S2O3)、硝酸银(AgNO3)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为抗氧化剂来防止核桃组培褐变,分别将其设定为X1、X2、X3。按照三元二次回归组合设计,得到数学模型来达到精确控制褐变的目的,并且为核桃组织培养过程中如何控制褐变提供理论依据。结果显示：在抑

8、制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是Na2S2O3、AgNO3。【10】2.4.2纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化园二色谱分析表明莲藕PPo主要含有α