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1、杂交水稻 1996(5)·27·基础理论 BasicresearchAFLP的原理及其应用王 斌 翁曼丽(中国科学院遗传研究所 100101)提 要:AFLP是检测DNA多态性的一种新的分子标记技术。对其起源、基本原理、技术程序和应用范围及前景进行了介绍和描述。关键词:分子标记技术 AFLP 原理 应用1 分子标记技术的快速发展记,不管所研究的基因组DNA有多么复杂,理论上在过去10a中,分子标记技术得到了突飞猛进讲,用AFLP方法都可以检测出任何DNA之间的的发展,至今已有10余种分子标记技术相继出现,并多态性。在各个研究
2、领域得到了应用。其中在植物分子生物2AFLP的发展及其基本原理学领域中应用最广泛的是RFLP和RAPD。RFLPAFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymor2的结果稳定可靠,重复性好,特别适应于建立连锁phism)是1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展〔1,2〕图,例如水稻RFLP连锁图的建立。RFLP比较起来的一种检测DNA多态性的新方法。由于它具作图进一步揭示了在主要粮食作物中,RFLP标记有重要的实用价值,一出现就被Keygene公司以专〔3,4〕〔7〕在染色体上的排列具有类似的顺序
3、。因此RFLP利形式买下。由于AFLP较其它分子标记有着明自出现至今虽然已有10多a了,但它仍是当今应用显的优越性,因此迅速传播开来,尽管它已受到了专最广泛的一种分子标记。然而,RFLP必须经过滤膜利保护,但世界上很多实验室都在努力探索在自己转移和Southern杂交,费时、费力、周期长。另外,的研究中应用AFLP技术。因此Zabeau和Vos不〔7〕RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高,RFLP连得不将其专利解密,并以论文形式正式发表出〔8〕锁图上还有很多大的空间区,这限制了它的进一步来。至今正式发表的关于AFLP的论文
4、还不发展。PCR对分子标记技术的发展产生了巨大的推〔8～10〕多,可是实际上做这方面研究的人已很多。动作用,迄今所用的分子标记技术尽管可以分为多与RFLP类似,AFLP也是通过限制性内切酶种类型,其实除了以传统的Southern杂交为基础的片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分RFLP外,其它各类分子标记都涉及PCR。RAPD就子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片是以随机引物为模板通过PCR扩增进行DNA多段扩增,然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序态性研究的,与RFLP相比,它较便宜,方便易行,非分析胶上
5、进行电泳,多态性即以扩增片段的长度不常灵敏,DNA用量少,而且不需要同位素,安全性同被检测出来(附图)。实验中酶切片段首先与含有好。继RFLP之后,RAPD是应用最广泛的,特别是与其共同粘末端的人工接头连接,连接后的粘末端在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,近年来报顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合道了大量的与各种目的基因连锁的RAPD标记。近位点。实验中,根据需要通过选择在末端上分别填加来西红柿Pto基因和水稻Xa21基因的成功分离就了1～3个选择性核苷的不同引物,可以达到选择性是首先找到了与目的基因紧密连锁的R
6、APD标记,扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性然后通过MBC(Mapbasedcloning)方法克隆了目地识别具有特异配对顺序的内切酶片段,进行结合,〔5,6〕的基因。但是RAPD受条件影响很大,因此对设导致特异性扩增。备、条件及操作的要求都很严格,如果达不到要求,3AFLP的基本反应程序稳定性和重复性就难保证。AFLP反应程序主要包括模板DNA制备,酶切AFLP是在RFLP和RAPD的基础上发展起片段扩增及凝胶电泳分析3个步骤:来的。它是RFLP和RAPD的结合,但不是笼统的3.1 模板DNA制备结合,它克服了
7、二者各自的缺点,而集中了二者的长在进行AFLP分析时,首先要制备高分子量处。它既有RFLP的可靠性,也具有RAPD的方便(HMW)基因组DNA,然后用两种限制性内切酶酶〔7,8〕性。AFLP被认为是迄今为止最有效的分子标切,通常一种酶的识别位点是6个碱基,另一种是4©1995-2005TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.·28·杂交水稻 1996(5)个碱基,如EcoRÉ和MseÉ,选择这样两种酶共同酶切可以产生比较小的酶切片段,经过PCR反应扩增出的产物
8、主要在lkb左右,范围可能在100～1500bp。HMW基因组DNA的成功制备和避免部分降解是AFLP成功的关键。在制备过程中要特别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染。在用限制性内切酶酶解时,一定要彻底。DNA酶切完成后,经加热使限制性内切酶失活,再把酶切片段连结到特定的接头(adapte
