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1、北京中医药大学学报第28卷第2期2005年3月·26·JournalofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicineVol.28No.2Mar.2005·科技之窗·3清开灵有效组分透过体外模拟血脑屏障的研究1234431高永红王永炎肖盛元叶丽亚娄晋宁罗国安王硕仁(1北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室北京100700)(2中国中医研究院北京100700)(3清华大学药物研究所北京100084)XXX(4中日友好医院临床研究所北京100029)摘要:目的检测清开灵有效组分在体外模拟血脑屏障中的透过率。
2、方法应用脑微血管内皮细胞单层培养模型体外模拟血脑屏障,用高效液相色谱-质谱(LC/MS)分析方法,检测清开灵有效组分栀子苷、黄芩苷、牛胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸在24h内的透过率。结果透过率从高到低依次为栀子苷、牛胆酸、猪去氧胆酸和去氧胆酸。在滤液中未检测到黄芩苷。结论清开灵有效组分在体外模拟血脑屏障中有较高的透过率,其透过机制和药理作用值得进一步研究。关键词:清开灵;有效组分;血脑屏障;透过率中图分类号:S28515由于血脑屏障的存在,几乎所有大分子药物和Trap;ESI源。98%的小分子药物都不能进入大脑及中枢神经系112实验方法[1]统,而药
3、物能否跨越血脑屏障并达到有效的治疗11211小鼠脑微血管内皮细胞(MB2MVEC)的分离浓度是至关重要的。为寻找和进一步分析清开灵多与培养:脑微血管内皮细胞由中日友好医院临床研环节、多靶点的生物效应和途径,本实验应用了脑微究所提供,从6～8周龄的BALB/c小鼠脑皮质分血管内皮细胞单层培养模型体外模拟血脑屏障离,其分离方法参照文献[2]。本实验所使用的脑微(blood2brainbarrier,BBB),用高效液相色谱-质谱血管内皮细胞为第8代,以ECCM(DMEM,20%胎牛(LC/MS)分析,在24h内不同时间点测定清开灵注血清,100000U
4、/L青霉素,100mg/L链霉素,2射液中有效成分栀子苷(geniposide)、黄芩苷mmol/L谷胺酰胺,100mg/L内皮细胞生长因子(baicalin)、牛胆酸(cholicacid)、猪去氧胆酸(hyo2(ECGS),40000U/L肝素培养。deoxycholicacid)、去氧胆酸(dexocholicacid)的透过11212BBB体外实验模型:采用单层内皮细胞培养率。体外模拟正常状态血脑屏障。细胞插入器预先以21材料与方法%明胶包被,将脑微血管内皮细胞均匀地接种在242111材料与仪器孔细胞插入器中,密度为200000个/cm,在
5、5%DMEM培养基,胰蛋白酶(Sigma公司);血清CO2,37℃孵箱中培养至汇合状态,经透射电镜证实(Heclon公司),内皮细胞生长因子(ECGS)由中日友形成细胞间紧密连接,跨细胞电阻增大,辣根过氧化好医院临床研究所病理生理室提取。细胞培养用物酶(HRP)4h通透率为0133%,具备了BBB的基24孔板与细胞插入器(8μm孔径,716mm直径,膜本特性,该部分内容另见文献[3]。加入药物前进行2面积0145cm)系Falcon公司产品。甲醇(Fisher公4h液面试漏实验,将培养基加入到供池内,使供池司,色谱纯),胆酸、黄芩苷、栀子苷标准品由
6、清华大与受池的液面差>015cm,4h后若仍能保持明显的学罗国安教授实验室提供,以脑微血管内皮细胞完液面差,为试漏实验阳性,认为BBB基本形成。全培养液(ECCM)溶解,0122μm滤膜过滤后备用。11213药物透过BBB体外实验模型的通透性实验:液相色谱质谱联用仪:Agilent1100SeriesLC/MSD选择试漏实验阳性的孔进行通透性实验,向供池中X高永红,女,29岁,在读医学博士生XX国家重点基础研究发展规划项目(No.G1999055404)第2期高永红等清开灵有效组分透过体外模拟血脑屏障的研究·27·加入栀子苷、黄芩苷、猪胆酸、牛胆酸
7、药液(50mg/L)泡和内皮细胞膜表面的负电荷也是血脑屏障的独特各1mL,受池中加2mLECCM。在第0、2、4、8、12、特征。因此,体外BBB模型的核心是培养脑微血管24小时分别从受池中小心收集滤液各200μL于内皮细胞,可以通过建立内皮细胞单层培养模型体[4～6]4℃保存,待所有取样结束后做样品处理。分别向外模拟BBB来研究药物的通透性。滤液中加2倍量甲醇,超声处理20min,经4℃,本实验应用内皮细胞单层培养模型进行体外模5000r/min离心10min,取上清液,作LC/MS分析。拟BBB,该模型经过形态学、电阻和通透性方面的鉴11214
8、透过率计算:根据LC/MS分析所得各时间定,具备了BBB的基本特性,适用于中枢神经系统点所取滤液浓度计算受池中的总透过量占
