酶工程论文 酶的固定化方法..pdf

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1、酶的固定化方法李启东0810135酶在现代生物生产中扮演着重要角色。酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。本文结合当前酶的固定化研究和本人的一些观点，论述酶的固定化简史和方法。酶的固定化有很多优点。将酶固定化以后，既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不

2、足之处，使其具有一般化学催化剂能回收反复使用的优点，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化。事实上，早在1916年，Nelson和Griffin就用吸附的方法实现了酶的固定化，他们将蔗糖酶吸附在骨炭粉上，发现吸附以后酶不溶于水而且具有和液体酶同样的活性，然而这个重要的发现长期以来没有得到酶学家的重视。直至1953年Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、羧肽酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等酶与这种载体结合，制成了固定化酶。酶的固定化方法很多，包括吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、无载体固定化和不同固定方法联用。固定化以尽可能保持酶的催化活性及专一性、酶与

3、载体必须有一定的结合程度、固定化酶应有最小的空间位阻、固定化酶的成本适中等为原则。（一）吸附法利用酶与载体之间的范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等作用力实现固定化，分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。该法操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，但酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，使用受限。常与交联法结合使用。离子吸附法是通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。所使用的载体是某些离子交换剂，如DEAE-纤维素和混合胺类(ECTEOLA)-纤维素等（阴离子交

4、换剂）、IRC-50、IR-200、Dowex-50等（阳离子交换剂）。该法吸附容量一般大于物理吸附剂，操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。（二）包埋法将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中（凝胶包埋法）或高分子半透膜内（微胶囊包埋法）的固定化方法。凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。（三）共价结合法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。包括溴化氰法、乙基氯甲酸酯法、碳二

5、亚胺法、重氮法、3-氨基丙基三乙基氧硅烷法、戊二醛活化法、叠氮法。下面简要列举一些共价结合法。溴化氰法是用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。由于该法可在非常缓和的条件下与酶蛋白的氨基发生反应，近年来已成为普遍使用的固定化方法。尤其是溴化氰活化的琼脂糖已在实验室广泛用于固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的

6、共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。叠氮法是将载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。由上面的例子可以看出，用共价键结合法制备的固定化酶，酶和载体之间都是通过化学反应以共价键偶联。由于共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。但是采用该法时，载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象

7、变化，需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。（四）交联法是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反应，酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。常用的双功能试剂有戊二醛(最常用)、己二胺、异氰酸衍生物等。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成希夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶