血红蛋白与核黄素的凝胶层析.ppt

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1、血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离第四组：吴秀、李庆慧、魏凤麟核黄素血红蛋白层析技术一层析技术的概念和特点任何层析都有两层:固定相与流动相，两相互不溶。固定相由层析介质组成，可以是固体或液体。这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解于交换作用，对层析的分离效果起关键作用。流动相只在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一定方向移动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱剂。它也是层析中的重要影响因素之一。层析法的特点：具有极高的分辨效力具有极高的分析效率具有极高的灵敏度应用广泛局限性：在定量分析中需要纯制的标准物质不能精

2、确地解决物质的化学结构问题二常用的层析方法1、凝胶层析2、离子交换层析3、亲和层析4、吸附层析5、分配层析凝胶层析（一）原理：分子筛作用（二）凝胶层析介质：交联葡聚糖、交联琼脂糖凝胶、丙稀酰胺琼脂，Sephacryl以及Superdex等。（三）特点：(1)、操作条件温和，不会引起生物大分子的变性失活；(2)凝胶层析柱可反复使用，每次洗脱过程即是凝胶的再生过程；(3)、实验具有高度的重复性，回收样本几乎可达100%，既可用于大样本制备，亦可用于小样品的分析。（四）应用：(1)脱盐；(2)高分子溶液的浓缩；(3)蛋白质分子量的

3、测定；(4)生物大分子的分离提纯。（五）缺点：上样体积较小，仅占柱床体积的2~5%。样品浓度会发生数倍稀释。柱层析示意图实验目的1：掌握凝胶层析原理。2：掌握柱层析的基本装置。3：熟悉凝胶层析的操作过程。实验原理（1）凝胶层析原理：凝胶层析是指混合物随流动相流经有以凝胶作固定相的层析柱时，混合物中各种成分因分子大小不同而被分离的技术，又称凝胶过滤和分子筛层析等。凝胶层析原理是分子筛作用，凝胶层析柱中装填着许多直径小于1毫米的凝胶颗粒（不是实心的),而是具有三维多孔网状结构，在洗脱中，大分子先流出层析柱，然后为小分子。（先大后

4、小）（2）凝胶层析介质：层析用的凝胶一般成球形，颗粒大小通常以目数表示。层析的分辨率和流速与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差。一般常用的是100~200目。（市场上层析用凝胶有交联葡聚糖凝胶，交联琼脂糖等)实验器材与试剂器材1.2x40cm层析柱721E型分光光度计恒压贮液瓶自动部分收集器试剂1：葡聚糖凝胶SepadexG-252：血红蛋白与核黄素的混合液3：洗脱液：0.05mol/LpH7.3磷酸缓冲液或者生理盐水实验操作1、凝胶处理溶胀与浮选：将凝胶干粉放入过量水中浸泡24小时或沸水水浴中2小时。浸泡后，搅

5、动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。2、层析柱的预备用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用毛刷，以免擦伤层析柱内壁，影响层析分离效果。固定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡，待气泡排出后，使溶液在底部留至3~5cm高即关闭出水口。3、装柱将处理好的凝胶在烧杯内用1倍体积的溶液搅拌成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开底端出口管，随之继续缓

6、慢添加凝胶悬液直至凝胶沉积至25cm高度为止。操作中注意防止气泡与节痕产生。4、平衡装好后，使层析床稳定5~10分钟，然后接上高位槽，打开出口活塞，调节高位槽的高度，控制流速为1ml/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳定。操作过程中应特别注意：(1)在平衡与洗脱时要将高位槽至层析柱的连接管内气泡全部排除，以免影响流速；(2)恒压高位槽内玻璃管底端口与柱底端口之差不能大于40cm，以免压力过大，导致凝胶颗粒变形；(3)平衡过程中务必防止流速过大导致层析床液体流干。防止层析床液体流干的最简单方法是使连接高位槽与层

7、析柱之间的导管成U型，U型管底部低于层析柱的出口；(4)如果需要温度平衡，可同时在层析柱夹套内通入恒温水。5、加样与洗脱打开平衡好的层析柱底部出口，使柱内溶液流至与床表面相切时关闭出口。将吸有0.5ml样品的加样滴管在床表面上1cm处沿管内壁轻轻转动加样。加完后，打开底端出口使样品流至床表面。关闭出口，用少量洗脱液同样小心清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面。然后将洗脱液加至距床表面2~3cm高，接上高位槽并调好流速即开始洗脱。注意在加样和洗脱过程中应缓慢加入液体，防止冲坏床表面，影响分辨率。6、收集与测定收集时可使用自动部

8、分收集器或手工操作，每管接洗脱液3ml，共收集15管。收集后用721E型分光光度计在450nm波长处以洗脱液为空白，对每管收集液（或洗脱体积）为横坐标，光密度为纵坐标绘制洗脱曲线。【注】市场凝胶如需彻底处理，可在溶胀后再用0.5NaOH-0.5NNaCl溶液在室温中浸泡半小时，但注意必须避