8碱性磷酸酶比活力测定.ppt

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1、碱性磷酸酶比活力的测定1.学习分光光度法测定的原理和方法2.掌握碱性磷酸酶比活测定的方法一、目的要求二、原理(一)、比色分析法光的互补示意图1.物质的颜色和波长:可见光:波长(λ)400—760nm紫外光:λ小于400nm红外光:λ大于760nm2.溶液的颜色和光吸收的关系:溶液的颜色,是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多,呈现的颜色越深。3.物质浓度,液层厚度与光吸收的关系(Lambert--Beer定律):当一束单色光通过溶液后,光被溶液吸收的程度(D)与溶液的浓度(C),液层的厚

2、(L)以及入射光的强度(I0)有关。溶液浓度越大,液层越厚,吸光越多,这就是物质(均匀透明固体,液体,气体)对光的吸收定律。4.待测溶液浓度的计算:(1)标准管法:在同样条件下,测得标准液和待测液的光密度(D)值,然后计算:C未知=(D未知/D标准)×C标准(2)标准曲线法:分析大批待测样品时,采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液,测出它们的光密度(D)值。在一定浓度范围内,溶液浓度(C)与其光密度(D)之间呈直线关系。以各管D为纵坐标,C为横坐标,绘制标准曲线。待测溶液D值测出后,在曲线上查出C。1%浓度,1cm厚度溶液中测得:K=E1cm1%或1克分

3、子浓度,1cm厚度溶液中测得:K=ξC=D/E1cm%,或C=D/ξ常用于紫外吸收法测定蛋白质,核酸含量,二者分别在280nm和260nm处有最大吸收,其消光系数可查到,在同样条件下,测定待测溶液的光密度,带入上式即可求得C。(3)消光系数法:(二)、酶活力在37C下,以5mmol/LpNPP为底物,在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg2+的测活体系中每分钟催化产生1mol/LpNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。酶活性测定前处理1、2号样品稀释50倍(用洗脱液稀释)3号样品稀释20倍(用洗脱液稀释)4号样品不

4、稀释(用洗脱液稀释)蛋白浓度测定前处理1、2号样品稀释100倍(用洗脱液稀释)3号样品稀释20倍(用洗脱液稀释)4号样品对倍稀释(用洗脱液稀释)12支试管,1-4做两组平行测定管,01-04作为空白对照管号空白(01-04)1-12-23-34-45mMpNPP(mL)各0.2mLNa2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mLH2O(mL)各0.50mL混匀,37℃,5分钟酶液(mL)/各0.1mL37℃,精确反应10分钟0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL酶液(mL)0.1mLOD405nm蛋白

5、浓度测定1.测定100μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值;2.将稀释后的样品在280nm下测定吸光度;3.以洗脱液作空白。蛋白浓度按下式计算:数据处理单位时间0.1mL酶液催化产物量计算:克分子消光系数法即C未知=OD/(8.8103)计算:式中:A为稀释倍数,B为由消光系数法计算得的pNPmol数,t为反应时间,C为测得的蛋白mg数,V1为测定酶活力所用的酶量(mL数)V2为测定酶活力所用的酶量(mL数)酶的比活力(U/mg)=酶活力(U/mL)/蛋白浓度(mg/mL)纯化倍数=各步比活力/第一步比活力得率%=各步总活力100/第一步总活力A

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