菌种的接种及菌悬液制备操作程序.doc

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1、菌种的接种及菌悬液制备操作程序一、菌种的接种：1、菌种的复苏：1.1　把冻干菌种管、灭菌1ml毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或超净工作台。1.2　将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使冷而炸裂。1.3　取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取一支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种

2、管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面置35～37℃培养22～24小时。1.4　取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3代即可应用。如发现菌形不典型，可进行平板分离单菌落。　2、菌种的接种：2.1　准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌名及接种日期。自冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。2.2　点燃酒精或其他灯，在左手握住菌种斜面，将管口

3、靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30分钟，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开棉塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管品移至火焰旁。堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。2.3　取出接种棒，在火焰旁将培

4、养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。2.4　将已接种毕的细菌管置35～37℃培养22～24小时，霉菌管一般置24～25℃霉菌培养箱内培养7日。二、菌悬液的制备：1、短小芽孢杆菌悬液　取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物加灭菌水1～2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬液种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布。在35～37℃培养7日。取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在70～75℃水浴内

5、加热30分钟将菌体杀死，待冷后冰箱贮藏为浓菌液。2、大肠杆菌悬液　取大肠杆菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时，临用时，取大肠杆菌的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，制成悬液，在36±1℃培养18～24h后使用。此菌液只供当天使用。3、沙门菌　取沙门菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，照大肠杆菌悬液制备方法进行，此菌液只供当天使用。